제12장

폴리갈락토사민

제12장 폴리갈락토사민

최근, 키틴·키토산의 연구가 성행하여 현재는 그 성과의 수확기에 들어섰으며 키토산 유사당으로서 폴리갈락토사민에도 또한 주목이 모아지고 있다. 애초에 폴리갈락토사민이 누룩균 Aspergillus parasiticus의 배양액 으로부터 다당으로써 처음으로 분리 정제된 것은 1960년 이었다. 그 후의 연구에서 몇종류의 미생물도 폴리갈락토사민을 생산한다는 것이 확인되었다. 그러나 호모 다당으로써 분리, 정제된 예는 극히 적고, Aspergillus parasiticus 외에는 □-1,4 결합 폴리갈락토사민을 생산하는 PaecilomycesⅠ-1균과 □-1,3 결합의 N-아세틸폴리갈락토사민을 생산하는 Pseudomonas Solanacearum의 2가지 예밖에 없다. 그 외의 예로써는 겨우 중성당과 단백질을 함유한 □-1,4 폴리갈락토사민을 생성하는 Cardyceps ophioglossoides가 있다. 지금까지는 폴리갈락토사민의 입수난이 연구의 족쇄가 되었던 면도 있지만 최근, 시판의 폴리갈락토사민도 입수 가능하게 되어 금후의 연구의 진전이 기대된다. 특히, □-1,4 폴리갈락토사민은 기능, 구조와도 키토산과 매우 비슷하여 그 연구는 키토산의 연구와 서로 어울려서 진전될 물질로 확신한다.

본 장에서는 우리들이 발견한 PaecilomycesⅠ-1균이 생산하는 □-1,4 폴리갈락토사민에 대해서 실험법을 서술한다.

12.1 폴리갈락토사민의 생산

12.1.1 미생물에 의한 □-1,4 폴리갈락토사민의 생산

□-1,4 폴리갈락토사민은 PaecilomycesⅠ-1균에 의해 균체외에 생산되는 분자량 약30만의 호모다당이다.

Paecilomyces는 불완전 균으로 분류되는 사상균으로 24℃의 호기적 조건에서 표-12.1과 같은 비교적 간단한 배지에 잘 생성되고 폴리갈락토사민을 배지중에 축적한다. 동시에 글루코스로부터 생성되는 중성다당도 폴리갈락토사민의 60∼80% 정도 생산된다. 이 중성다당은 배양액중에서의 폴리갈락토사민의 용해성에 관여하고 있다고 생각된다.

표-12.1 폴리갈락토사민 생산배지

조성	(%)
蔗糖	5
펩톤	1
CaCl2·2H2O pH7.0으로 조정	0.6

탄소원으로써는 글루코스, 프락토스, 갈락토스 등의 단당, 말토스, 자당, 락토스등의 이당의 어느쪽이든 좋지만 오토클레이브중의 갈변을 억제하기 위해서는 환원력이 없는 자당이 좋다. 갈변물질이 많으면 폴리갈락토사민의 생산성이 저하와 생산물의 색조에 조금씩 영향을 준다.

더욱이 폴리갈락토사민을 효울좋게 생산시키기 위해서는 균의 생육과정과 폴리갈락토사민의 생산과정을 나누어서 행하면 더욱 좋은 결과가 얻어진다. 즉, 本균의 경우, 배지나 진탕조건에 의해 균사체가 펠렛트상 또는 펄프상을 나타내게 된다. 폴리갈락토사민의 생산에는 균체량이 많은 펄프상이 좋고 그를 위해서는 종균의 진탕배양의 탄소원에 점도가 높은 전분을 이용하는 것이 좋다.

최적 생육온도는 30℃이고, 폴리갈락토사민의 최적 생산온도는 그것보다 6℃ 낮은 24℃이다.

질소원에 대해서는 카자민산이나 효모엑기스로도 대체할 수 있으나 펩톤이 더 양호하고 경제적이다.

[Paecilomyces의 배양법]

① 보존스란트

↓

② 전분배지

30℃, 진탕배양, 3일

↓

③ 자당배지(표-12.1)

27℃, 쟈파멘타

통기교반(0.5VVM, 200rpm)배양, 5日

그림-12.1에 통기교반 배양의 경과를 나타내었다. 배양 5일째가 되면 배양액은 극도로 점조하게 되며 배양의 계속이 어렵게 된다. 이 때, 생산된 폴리갈락토사민량은 3g/L에 이른다.

그림-12.1 통기교반배양에 의한 폴리갈락토사민의 생산

12.1.2 폴리갈락토사민의 정제

PaecilomycesⅠ-1의 배양액은 상당히 점조하여 배양탱크로부터 용이하게 나오지 않으므로 배양액과 동용량의 수도수를 가하여 점도를 떨어뜨려서 나오게 하면 좋다. 연속원심기(10,000rpm)로 균체를 제거하고 상등액을 60℃로 가열하여 배양액중에 잔존하는 단백질을 열변성시키고 동시에 한외여과막(분획분자량 100,000)처리하여 농축 후, 다시 원심분리(10,000rpm)하고, 단백질을 제거하여 상청액을 얻는다.

다당의 정제에 잘 이용되는 에탄올등의 유기용매에 의한 침전법은 배지중에 공존하는 중성다당도 동시에 침전시키므로 이 경우는 좋지 않다.

얻어진 청등액의 pH를 8.5로 조정하고 고형의 식염 또는 유안을 20%가 되도록 가한다. 식염의 경우에는 가염후에 pH를 조정해도 좋지만 유안의 경우 순서를 바꿔서 하면 대량의 암모니아가 생성되어 좋지 않다. 식염, 유안뿐만 아니라 그 외의 용해도가 높은 염류(초산염, 인산염등)라면 염석은 가능하다. 염석의 결과 폴리갈락토사민은 불용화하여 침전하고, 배지중에 동시에 생성된 중성다당이나 배양물중의 제성분등은 분리된다. 중성다당이 공존하지 않는 폴리갈락토사민은 염석공정 이후에 물에녹지 않게 된다. 그래서 침전물을 수세하여 식염등의 염류나 미세하게 남아이Tssm 중성다당 등의 불순물을 용이하게 제거할 수 있다. 그러나 폴리갈락토사민은 0.1M 염산이나 초산등에는 용해되므로 침전물을 이들 산에 용해하고 불용해 물질을 원심제거한 후 pH를 8∼9로 조정하면 폴리갈락토사민은 다시 침전한다. 이 용해, 침전의 조작을 반복하고 동결건조 하면 거의 純粹한 폴리칼락토사민 분말을 얻을 수 있다.

[폴리갈락토사민 정제법]

①PaecilomycesⅠ-1균 배양액

↓+수도수(배양액과 동량)

②원심분리(10,000rpm) 除균체

↓

③가열(60℃) 단백질의 열변성

↓

④한외여과막(분획분자량, 100,000)처리, 농축

↓

⑤원심분리(10,000rpm), 除단백질

↓

⑥pH조정(pH8.5∼9.0)

↓

⑦식염첨가(NaCl, 20%)

↓

⑧水세정, 除가용성물질

↓

⑨0.1M-HCl첨가, 再용해

↓

⑩pH조정(pH8.5∼9.0), 재침전

↓

⑪용해, 침전을 반복한다.(보통3회 정도)

↓

⑫동결건조

↓

⑬정제 폴리갈락토사민

12.2 폴리갈락토사민의 분석

12.2.1 全갈락토사민의 분석

(1) 인돌 염산법(Dische-Borenfreund)

폴리갈락토사민의 화학적 분석에서 제일 간편하고 신뢰성이 높은 방법은 인돌염산법이다. 이 방법은 아질산에 의한 탈아미노와 環狀무수물의 생성과정을 포함하므로 글리코실 결합이 절단되어 미리 가수분해 하지 않고 全갈락토사민을 정량할 수 있다.

[시약] 아질산 나트륨 액-5% 아질산나트륨 수용액, 사용시 조정

초산용액-33%초산용액

설파민산 암모니움액-12.5% 설파민산 암모니움 수용액

염산용액-5%염산

인돌용액-1%인돌/에탄올용액

[조작] 시료 0.5ml(갈락토사민 10∼200□)에 아질산 나트륨액 0.5ml와 초산용액 0.5ml를 가하여 잘 혼화하고 10분간 방치하여 탈아미노 반응시킨다. 설파민산 암모니움액 0.5ml를 가해서 30분간(때때로 교반하여 發泡시킨다.) 방치하면 과잉의 아질산이 소거된다. 탈아미노된 시료에 염산용액 2.0ml와 인돌액 0.2ml를 가하고 비등수욕중에 5분간 가열하면 橙색으로 발색한다. 2.0ml의 에탄올을 가하여 492nm의 흡광도를 측정하고, 갈락토사민(모노머)을 스탠다드로한 검량선으로부터 갈락토사민량을 구한다.

본 측정법에서는 전체의 액량이 많아지므로, 필자등은 이것의 1/2스케일로 가열시간을 4분간으로 하였다. 가열조건을 일정하게 할 필요가 있고 동질의 엷은 시험관을 사용한다. 더욱 정밀하게 하려면 가열 롯트에 스탠다드를 취하는 것을 권하고 싶다. 본 방법으로 폴리갈락토사민을 측정할 때 이론치의 95∼97%의 수치를 나타낸다.

이 방법의 단점은 N-아세틸화된 칼락토사민에는 반응하지 않는 것으로 全당량을 정량하려면 N-아세틸기를 미리 없앨 필요가 있다. 2M 연산으로 100℃, 2시간 처리하면 탈아세틸화가 가능하다. 염산처리 후의 폴리갈락토사민은 이론치의 97∼99%의 수치를 나타낸다.

(2) Elson-Morgan법

이 방법은 단당으로 밖에 반응하지 않으므로 미리 시료를 가수분해 할 필요가 있다. 4M 염산, 100℃, 16시간의 처리 후, Elson-Morgan법(Blix변법)으로 폴리갈락토사민을 정량 할 때 이론치의 80∼85%의 치를 나타낸다. 정량치가 낮은 것은 일부 過분해가 일어나는 것과 소량의 갈락토사민 올리고당이 미분해 자체로 남아있기 때문이다.

12.2.2 구성당의 정량

정제 폴리갈락토사민을 10mg 시험관에 재서 취하고 4M 염산 5ml를 가하여 空寸部를 질소가스로 치환한 후 시험관을 봉한다. 이어서 100℃의 알루미늄 브롯크 분해로로 16시간 가열분해 한다. 냉각 후, 시험관을 개관하고 불용물을 분별한다. 여과액을 50∼60℃의 수욕중에서 감압건고하여 오산화인 데시게이터 중에 14시간 이상 유지한다. 여기에 트리메칠케이 素化劑를 200□가하고, 60℃에서 10분간 가온하여 TMS化 한다. 이것의 1□를 인젝트해서 가스크로마토그라피로 정량한다. 본 방법으로 정제 폴리갈락토사민을 정량할 때 이론치의 80∼86%가 회수된다. 그림-12.2와 같이 갈락토사민 이외의 피크는 인지되지 않는다.

[가스크로마토그라피의 조건] 칼럼-내경 2mm, 길이2m의 글라스관 칼럼에 GS-101(가스크로공업製 충진제)을 충진한 것

그림-12.2 칼락토사민의 가스크로마토그라피 패턴(수치는 리텐션 시간(분))

칼럼온도-160∼210℃, 매분 5℃ 승온

캐리어가스와 유량-질소가스, 매분25ml.

검출기-수소炎이온 검출기

12.2.3 분자량

폴리갈락토사민은 칼럼충진제에 붙는 흡착력이 강하여 Sephadex 등의 데스트란, Bio gel 등의 아크릴아마이드, HW등의 합성폴리머에는 강하게 결합하여 유리하지 않는다. 예외적으로 아가로스겔인 Sepharose에서는 초산, 크엔산등 카르복실기를 가진 유기산에 용출된다. 여기에서, Sepharose 4B를 1M 초산으로 평형화하고 겔여과를 행하였다. 결과는 그림-12.3에 나타내었듯이 분자량 약30만에 브로드한 피크를 확인하였다.그 외의 폴리갈락토사민은 약10∼200만의 범위에 넓게 분포하였다. 이처럼 발효생산된 다당의 분자량 분포가 넓은 것은 드문일이 아니다.

그림-12.3 폴리갈락토사민의 겔 여과

12.2.4 N-아세틸화율의 정량

폴리갈락토사민의 N-아세틸화율은 가볍게 염산분해해서, 탈아세틸화하고 생성된 초산을 정량하는 방법, IR법, 콜로이드 적정등의 방법이 있다. 폴리갈락토사민 10mg을 20ml의 2M 염산에 분산시키고 시험관을 봉하고 100℃, 2시간 분해한다. 분해후, 純水로 20ml로 定容한다. 이 용액의 100∼200□를 盛進製藥社製 카본산 분석계로 초산을 정량한다.

폴리갈락토사민의 N-아세틸화율은 배양 롯트에 의해 3∼8%의 범위에서 변동하였다. 이처럼 배양조건에서 아세틸화율이 변화하는 것은 Aspergillus Parasiticus의 예에서도 확인되었다. 또한 콜로이드 적정법에서도 거의 같은 결과가 얻어졌으나 IR법과 다른법과는 반드시 일치하지 않는다.

12.2.5 적외흡수 스펙토르

충분히 건조한 폴리갈락토사민 약3mg을 취하고 취화칼륨 錠劑法으로 적외흡수 스펙토르를 측정하여 그림-12.4와 같이 3,400, 2,900, 1,690, 1,640, 1,330, 1,000, 810cm-1에서 흡수를 확인하였다.

그림-12.4 폴리갈락토사민의 적외흡수 스펙토르

12.2.6 선광도

정제 폴리갈락토사민 100mg을 0.1M의 초산 10ml에 용해하여 선광도를 측정한다. 이때 얻어진 선광도 [□]D는 +215∼+230°를 나타낸다.

12.3 폴리갈락토사민의 분해효소 활성의 측정

□-1,4 폴리갈락토사민을 분해하는 효소는 지금까지 4가지 예가 알려져있다. 그 중 정제된 효소화학적 성질이 밝혀진 것은 Pseudomonas sp. 881과 Bacillus sp. A-4 및 Bacillus sp.E-1의 3가지 예 뿐이다.(표-12-2). 모두가 폴리갈락토사민에 의해 유도된 엔도형의 효소이다. Pseudomonas의 효소는 4당 이상의 갈락토사민올리고당에 작용하는 것에 비하여 Bacillus sp. E-1은 3당도 분해한다.

표-12.2 □-1,4 폴리갈락토사민 분해효소의 성질

생산균의 종류	Pseudomonas-881	Bacillus A-4	Bacillus E-1
효소생산양식	폴리갈락토사민에 의해 유도생산 □-1,4 칼락토사민 폴리머
기질특이성
최소기질(n)*	4	?	3
분해양식	엔도형	엔도형	엔도형
분자량	31,000	60,000	60,000
등전점pI	6.7	9.0	9.5
최적 pH	4.5∼6.5	4.5	7.5
최적온도(℃)	55	60	60
저해제	Sn2+, Fe2+, Cu2+ Hg2+, SDS	Hg2+, Ag2+ PCMB	Fe2+, Cu2+, Hg2+ NBS.Zn2+, Ni2+ SDS
Km(%)	0.05	0.18	0.05

* : 구성당 중합도

12.3.1 폴리칼락토사민 분해효소 생산균의 검색

폴리갈락토사민 분해효소 생산균을 검색하는 목적에서 폴리갈락토사민을 유일ㄹㄹ한 탄소원으로 하는 배지를 이용하면 미생물이 전혀 생육되지 않는 것이 있다. 이것은 폴리갈락토사민이 이용되면 탄소원 이라는 것 이외에 항균작용을 갖고있기 때문인 것으로 생각된다.

그래서 필자등의 경우 탄소원에는 폴리갈락토사민 단독이 아니라 PaecilomycesⅠ-1균의 배양 상청의 에탄올 침전물을 이용하였다. 12.1.2에서 서술하였듯이 이 에탄올 침전 부분은 글루코스를 구성당으로 하는 중성다당을 30∼40%함유한다. 그 결과 필자등은 十數株의 분해효소 생산균을 분리한느것에 성공하였다. 그 중에서 제일 강한 활성을 나타낸 것이 Pseudomonas sp. 881이다.

12.3.2 폴리갈락토사민 분해효소 활성의 측정

폴리갈락토사민 분해효소의 활성은 간단하게는 폴리갈락토사민이 가진 기능의 하나의 응집활성을 지표로 측정할 수가 있다. 즉, 폴리갈락토사민은 키토산과 같이 미생물 균체를 시작으로 적혈구, 활성오니, 셀룰로스 파우더, 한천, 활성탄, 활성산화 알루미늄, 실리카겔, 규조토등의 미세한 물질을 응집시키는 성질을 갖고 있다. 피응집물질을 규조토로 했을 때, 폴리갈락토사민량과 응집활성과는 어느 범위에 있어서 직선관계가 성립한다.(그림-12.5) 그리고, 이 성질은 폴리갈락토사민의 고분자 상태에서 특유한 것으로 저분자화 되면 감소하고, 이어서는 소멸되고 만다. 그래서 효소반응액의 응집활성의 저하를 측정함으로써 폴리갈락토사민 분해효소의 활성을 측정 할 수가 있다.

그림-12.5 폴리갈락토사민과 응집활성

[효소반응계] 기질-0.5% 폴리갈락토사민/0.1M 초산완충액(pH6.0) 0.5ml

효소액 0.5ml

반응온도 37℃

반응종료와 동시에 1ml의 순수를 가하여(희석 1회) 잘 혼화하고, 거기에서 1ml를 취하여 1ml의 순수가 들어있는 다음의 시험관에 가한다.(희석 3회) 더욱 이것을 반복하여 몇배로 희석된 十數개의 희석계에 시험관을 만든다. 여기에 규조토(Celite 545, Johns-Manville) 현탁액 1ml를 가하고, 규조토의 응집유무를 관찰한다. 그리고 응집이 확인된 최대 희석 횟수를 응집활성으로 하여 n으로 표시한다. n=5라는 것은 원래의 갈락토사민 용액을 1/25(1/32)까지 희석하여도 여전히 응집력을 나타내는 폴리갈락토사민량이다.

그림-12.6은 폴리갈락토사민 분해효소의 반응을 경시적으로 측정한 것이지만, 효소반응의 진행과 응집활성의 저하(白丸)와의 사이에는 직선관계가 성립한다. 그러나 이 방법으로는 단백질이 많은 경우(폴리갈락토사민이 단백질도 응집시키는 것이 있다.)나 단시간의 효소반응에는 적당하지 않다. 한편, 그림-12.6의 환원당의 증가곡선(黑丸)을 보면, 어느정도 범위내에서는 효소반응의 진행과 직선관계로 된다. 이것은 이 폴리갈락토사민 분해효소가 엔도형의 효소라는 것과 관계없이 효소활성을 반응에서 생성된 환원력으로 표시한다는 것을 나타낸다. 그래서, 효소활성의 측정법을 다음과 같이 결정하였다.

먼저 효소반응계에 있어서 10분간 반응시킨다. 반응은 Somgyi액 1ml를 가하여 종료시키고, 비등수욕중에서 10분간 가열, 이것을 급냉한 후 Nelson액 1ml를 가해서 발색시킨다. 순수 2ml를 가하여 잘 혼화한 후 여지여과를 하여 미분해의 폴리갈락토사민을 제거하여 비색정량한다. 그리고, 1분간에 1□mol의 갈락토사민에 상당하는 환원력을 생성하는 효소량을 1단위로 한다.

그림-12.6 폴리갈락토사민 분해효소 반응의 경시변화

12.4 갈락토사미노올리고당의 조제

갈락토사미노올리고당을 얻는데에는 폴리갈락토사민을 적당히 가수분해하여 이것을 정제한다. 여기에는 2가지 방법이 있다.

한가지는 고농도의 鑛酸 또는 강알칼리를 사용하는 것이며 다른 한가지의 방법은 분해효소를 사용하는 것이다. 두가지 분해법의 특징을 표-12.3에 나타내었다.

표-12.3 가수분해법의 특징

	이점	단점
염산법	모노머로부터 고급 올리고당까지 얻어지며 아세틸기에의 배려가 불필요	고농도 염산, 고온, 대량처리는 위험 뱃치 반응으로 자동화, 省力化가 어렵다. UV흡수물질이 생성된다.
효소법	온화한 반응으로 위험이 없다. 탈색 불필요, 연속반응이 가능하고 자동화, 省力化가 가능하다.	얻어진 올리고당에 치우침이 있다. 탈아세틸처리를 필요로 한다.

12.4.1 염산분해법에 의한 조제

폴리갈락토사민(20g)을 4M 염산 500ml에 분산시키고, 냉각관을 부착하여 100℃, 8시간 가열한다. 냉각 후, 활성탄(100g) 처리하여 탈색한다. 10M 수산화나트륨으로 pH9로 조정하고, 旭化成工業社製의 전기투석기(마이크로아실라이저, G2)에 전기투석하여 식염을 제거한다. pH9까지 전기투석을 하는 것은 투석막 밖으로 갈락토사민(모노머)가 유출되는 것을 억제하기 위함이다.

전기투석기를 사용하지 않을 경우, 가수분해액으로 부터의 탈염산을 목적으로서 감압농축을 한느것은 좋지 않다. 이것은 갈락토사미노올리고당이 용액상태에서는 비교적 褐變하기 쉬운 성질을 갖기 때문이다. 그러나, 강음이온 교환수지를 사용하여 탈염산하는 것은 가능하다. 염산 분해 후, 탈색된 칼락토사미노올리고당 혼액을 Bio-Rad AG 3-X 4A(100∼200메쉬), OH-형 수지 충진 칼럼으로 처리하여 탈염산한다. 이 수지의 경우, 글라스관 칼럼을 사용하면 Cl-化의 상태를 관찰할 수 있어서 좋다.

탈염 또는 탈염산 후, 갈락토사미노올리고당 혼액을 pH5로 조정하고 50mM 초산완충액(pH5)으로 평형화 한 CM-Sephadex C-25(2.6×60cm)칼럼에 흡착시킨다. 그리고, 0∼3M의 식염의 직선적인 농도구배에 의해 각 갈락토사미노올리고당을 용출시킨다.

칼럼크로마토그라피의 결과를 그림-12.7에 나타내었다. 식염의 농도구배의 상승에 따라 갈락토사미노올리고당은 분자량이 작은 순서로 순차 용출된다. 이 때 얻어진 올리고당의 부분을 표-12.4에 나타내었다. 갈락토사미노모노머로부터 데카머까지 높은 회수율로 얻어진다.

그림-12.7 염산분해 갈락토사미노올리고당의 CM-세파덱스 칼럼 크로마토그라피의 용출패턴(①∼⑫ : 갈락토사미노올리고당 중합도(모노머∼도데카머)

그러나, 염산분해에서는 새로이 생성된 UV흡수물질이 각 올리고당의 피크의 바로전에 겹쳐져 용출한다. 이것을 제거하기 위해 다시 크로마토그라피를 반복할 필요가 있다.

표-12.4 염산분해에 의한 갈락토사미노올리고당의 회수율

갈락토사미노올리고당	회수율(%)
모노머(단당)	19
다이머(이당)	16
트리머(삼당)	10
테트라머(사당)	10
펜타머(오당)	6
헥사머(육당)	5
헵타머(칠당)	4
옥타머(팔당)	4
노나머(구당)	3
데카머(십당)	2

12.4.2 효소분해법에 의한 조제

폴리갈락토사민은 그의 분자내에 아미노기를 가지고 있다. 그러므로, 산분해의 경우 프로톤의 공격에 대해 강한 저항성을 나타낸다. 게다가, 그 가수분해에 있어서는 고농도의 鑛酸과 가열을 필요로 한다.

이것은 작업성을 현저하게 낮고, 작업의 합리화, 효율화를 방해하는 요인이 된다. 그래서, 효소에 의한 올리고당의 생산이 요망되게 되었다. 효소는 Pseudomonas sp. 881이 생산한 폴리갈락토사민 분해효소를 사용한다. 이 효소의 최적 pH는 5.5∼6부근이며 통상적으로 반응시키면, 갈락토사미노트리머 이하로 분해되게 된다.(그림-12.8상단) 그래서 반응조건을 검토한 결과, 반응은 최적 pH로부터 벗어난 4에서 행하면 고급올리고당이 많이 잔존하는것을 알 수 있다. 결과를 그림-12.8 하단에 나타내었다.

그림-12.8 효소분해 갈락토사미노올리고당의 CM-토요펄 650M의 칼럼크로마토그라피의 용출패턴(상단 : pH6, 하단 : pH4에 있어서 분해생성물)

갈락토올리고당 : 사선;디머, ?点;트리머, 점;테트라머, 횡선;펜타머, 가는사선;헥사머, 검은칠;헵타머, 옥타머, 노나머혼합, 백색:미분해폴리갈락토사민

그림-12.9 효소분해에 의한 갈락토사미노올리고당 생성의 경시변화(pH4)

다음으로 pH4에 있어서 생성물의 구성을 경시적으로 측정하였다. 그 결과를 그림-12.9에 나타내었다. 분해물의 평균중합도와 그 때에 얻어진 갈락토사미노올리고당의 부분을 나타내고 있다. 효소반응의 진행과 함께 회수된 촐리고당의 총량은 증가하고, 그 중에서도 트리머가 주로 생산된다. 그리고 분해가 상당히 진행되어도, 고급올리고당이 분해되지 않고 남아 있는 것을 알 수 있다. 이와같이 효소분해의 진행에 관계없이 pH의 제어로만 고급올리고당이 남게되므로 연속반응을 행하면 유리하다.

[연속반응법]

①폴리갈락토사민(200g)

↓

②50mM 초산용액(50L)

↓

③용해

↓

④pH조정(pH4)

↓+폴리갈락토사민 분해효소

⑤반응, 30℃

↓

⑥한외여과막처리

(MW 30,000이상)

(MW 30,000이하)

⑦CM-Toyopearl 650M(20×30cm×3)

↓+NaCl(0∼2M)

⑧용출, 분획

↓

⑨갈락토사미노 올리고당(n=2∼9)

먼저, 폴리갈락토사민(200g)을 50mM 초산완충액, 50L에 용해시킨다. 10M 수산화 나트륨으로 pH4로 조정하고, 폴리갈락토사민 분해효소를 0.2U/ml가 되도록 가한다. 반응용액을 30℃로 유지하고, 반응시키면서 한외여과막(분획분자량 30,000)처리하여 3만 이하의 올리고당 구分은 곧바로(M-Toyopearl) 650M 칼럼에 흡착, 농축한다. 충분히 완충액으로 세정한 후, 식염의 직선적인 농도구배에 의해 갈락토사미노올리고당을 용출시킨다. 그 때 얻어진 올리고당의 회수율을 표-12.5에 나타내었다.

표와같이 효소분해로 갈락토사미노올리고당이 다이머에서 노나머까지 얻어졌다. 필요한 경우에는 다시 크로마토그라피를 행하여, 정제 갈락토사미노올리고당을 얻는다.

표-12.5 효소법에 의한 갈락토사미노올리고당의 회수율

갈락토사미노올리고당	회수율(%)
모노머	trace
다이머	2
트리머	19
테트라머	3
펜타머	5
헥사머	5
헵타머	4
옥타머	3
노나머	2

12.4.3 갈락토사미노 올리고당

정제 갈락토사미노올리고당의 균일성은 HPLC로 검정한다. HPLC에서의 용출위치로부터 분자량 즉 중합도가 결정된다. 중합도는 선광도로 부터도 판정된다.

TSK gel NH260 칼럼으로 갈락토사미노 올리고당을 분석한다. 결과는 그림-12.10 왼쪽에 나타내었다.

그림-12.10 정제 갈락토사미노올리고당의 HPLC패턴

중합도의 증가와 함께 브로드한 피크가 되어 옥타머 이상에서는 피크가 얻어지지 않았다. 그래서 각 올리고당을 N-아세틸화해서 N-아세틸갈락토사미노올리고당으로 하고, TSKgel Oli해 PW칼럼으로 분석하였다. 결과는 그림-12.10 오른쪼에 나타내었다. 각 정제 올리고당은 단일의 피크를 나타내며, 높은 정제도의 표품이라는 것이 확인되었다.

【HPLC의 조건】

[갈락토사미노 올리고당]

칼럼-TSKgel NH260(4.6×2.5cm)

용매-아세토니트릴:水(55:45)

유속-1ml/min

칼럼온도-실온

샘플량-10□

검출기-RI

[N-아세틸갈락토사미노 올리고당]

칼럼-TSKgel Oli해 PW

용매-물

유속-1ml/min

칼럼온도-60℃

샘플량-10□

검출기-RI 또는 UV(210nm)

그림-12.11 분자선광도와 중합도와의 관계

[M]n : 분자선광도 n : 중합도(1<n)

선광도에 의한 중합도의 결정은 분자선광도와 중합도와의 사이에 직선관계(그림-12.11)가 성립하는 것에서 결정된다.

그의 일반식은

[□]n = n×103/(Mw)n{28.69(n-1)/n+7.23}

단, (1<n)이다.

12.5 맺음말

이상, 폴리갈락토사민, 갈락토사미노올리고당의 실험에 대해서 서술하였지만 이들에 관해 더욱 상세한 정보는 이미 技報堂출판으로부터 간행된「키틴, 키토산의 응용」(키틴, 키토산 연구회 編)을 참고하기 바란다.