제13장

키티나제 遺傳子의 클로닝 및 키티나제 단백분자의 아미노산 配列의 推定

제13장 키티나제 유전자의 클로닝 및 키티나제 단백분자의 아미노산 배열의 추정

13.1 키티나제 유전자의 클로닝과 유전자 조작

지금까지 몇가지의 미생물 및 식물의 키티나제 및 관련 효소의 유전자가 클론화 되었다. Serratia marcescens, S.liquefaciens, Streptomyces plicatus, Vibrio valnificus의 키티나제, Streptomyces plicatus의 두애-□-N-acetylglucosaminidase, Bacillus circulans WL-12 및 감자, 강남콩, 담배의 키티나제가 클론화 되었고, S.marcesens, B.circulans WL-12, 감자, 강남콩, 담배의 키티나제, S.plicatus의 두애-□-N-아세틸글루코사미니다제등의 유전자 염기배열이 결정되었다.

13.2 유전자 조작기술의 개요

(1) 목적으로 하는 유전자를 얻는 기술

① 목적으로 하는 유전자를 함유한 DNA단편(공여체DNA)을 세포등으로부터 추출, 정제하는 방법

② 목적의 유전자에 대응하는 mRNA를 세포등으로부터 추출하여, 역전사효소를 이용하여 cDNA를 작성하는 방법

(2) 組換 DNA분자의 작성

적당한 제한효소로서 DNA를 절단하고, 적당한 벡타로 결합한다(코스미드 벡타, □벡타, 플라스미드 벡타, 일체쇄 DNA파 벡타 등)

(3) 組換 □의 작성

조환 체가 그 중에서 복제 가능한 숙주세포 중으로 조환체를 이입한다.(형질전환, 형질도입, 트란스펙션).

(4) 조환체의 선택

① 유전학적 방법

② 면역학적 방법

③ 핵산의 하이브리다이제이션에 의한 방법

④ 효소활성의 개발

⑤ 그 외

여기에서는 주로 필자등이 행한 방법을 구체적으로 소개한다.

13.3 재료

(1) 균체

[키티나제 생산균] Bacillus circulans WL-12

[숙주] ① Escherichia Coli HB 101-F-, hadS 20, recA 13, ara-14, proA2, lacY1, galkz, rpsL20(str), xyl-5, mtl-1, supE 44, leuB6, thi-1.

② E.Coli JM 109-recAl, □(lac-pro), gyrA96, thi-1, hsdR17, relA1, F`[traD36, proAB, lacI8lacZ□M15]

(2) 배지

LB(Luria-Bertatri)배지-박토트립톤(폴리펩톤) 10g, 이스트엑스트랙트 5g, NaCl 5g, H2O 1,000ml, pH7.5

고체배지 일땐느 한천 15g을 가한다.

콜로이달 키틴을 첨가할 때는 상기배지에 건조중량으로 0.4%가 되도록 가하고, 초음파 발생기(Model VR-200P, TOMY SEIKO社)로 잘 분산시키고 안피시린(Amp)을 가할때는, 25mg/ml의 농도로 녹이고, 무균여과한 용액(Amp stock)을 오토클레이브 후, 50∼60℃ 정도로 식힌 배지에 100□/ml의 농도가 되도록 가한다.

(3) 벡타 플라스미드

PUC 18, PUC 19, pBR322, pKK223-3

pKK223-3은 tac 프로모터를 가진 발현 벡타로, 목적의 키티나제 유전자의 프로모터가 재장균중에서 작용하지 않을 경우를 예정하여 사용하였다. pUC계 벡타는 카피수가 많고 활성발현을 지표로한 클론의 검출에 특히 유용하다. JM시리즈등의 호스트를 이용함으로써 제일 유효하게 이용할 수 있다. 반대로 클론화된 DNA에 의해서는 카피수가 많아서 호스트에 치명적으로 작용하는 경우가 있다.

(4) 제한효소

특별한 이유가 없는 한 東洋紡製의 것을 이용한다.

13.4 실험방법

(1) 플라스미드 DNA의 추출과 정제

신속, 소량분리법(Rapid, miniprep법), 알카리 용해법(alkaline lysis miniprep). 소량의 배양액으로 부터의 조제법으로써 Birmboin과 Doly의 방법이 일반적으로 이용된다. 이하는 그 변법이다.

[준비] 리조치움 용액-리조치움(5mg/ml), 50mM 글루코스, 10mM-EDTA 25mM 트리스-산완충액(pH8.0) 보존액으로써 리조치움을 제거한 것을 작성하고, 사용직전에 리조치움을 가한다.

알카리 SDS용액-0.2N수산화나트륨-1% 라우릴황산나트륨(SDS)용액.

초산칼륨용액-5M 초산칼륨 60ml, 빙초산 11.5ml, 증류수 28.5ml(pH4.8).

TE-10mM 트리스-염산, 1mM-EDTA,(pH8.0)

[수순] ⓛ 1클로니를 LB배지에 식균하고, 하룻밤 배양한다.

② 이 배양액을 원심분리하고(1,500×g, 10분) 1.5mlxbqm에 집균(集菌)한다.

③ 균을 0.2ml 리조치움 용액으로 재현탁하고, 이것을 빙중(氷中)에서 5분간 인큐베이트한다.

④ 0.4ml 알카리 SDS 용액을 가하고, 충분히 튜브를 반전시키면 현탁액은 반투명 하게된다. 더욱 빙중에서 5분 인큐베이트한다.

⑤ 0.3ml 초산칼륨 용액을 가하여, 온화하게 섞고, 드아이아이스-에탄올중에 5분간(-80℃로 수십분간) 넣어서 동결시킨다. 그리고 나서 실온에서 채움.

⑥ 원심(∼12,000×g, 15분)하여 부유물을 침전시킨다.

⑦ 상청 0.75ml를 주의 깊게 별도의 에펜도르프 튜브에 옮긴다. 그리고 0.45ml 이소프로판올과 잘 섞는다.

⑧ -80℃에 10분이상 방치한다. 실온으로 하고나서 원심하여 DNA를 침전시킨다.

⑨ 상청을 제거하고 침전을 빙냉 70% 에탄올을 가하여 세정하고, 수분 원심하여 에탄올을 버린다.

⑩ 침전을 진공건조한다.

⑪ 50□ 정도의 TE에 용해하여 저온보존.

(2) 플라스미드의 대량 조제법

[원리] 박테리아의 1균체당 함유된 플라스미드의 수는 리랏크스형에서 10∼200(pUC계의 경우는 더 많다.)이다. 클로람페니콜 등의 단백질 합성저해제를 배지에 가하면, 염색체 및 스트린젠트형 플라스미드의 증식은 정지하지만 ColEI 유래의 pBR계와 같은 리랏크스형 플라스미드는 자기복제를 계속하여 그 결과 세포당 1,000∼3,000이 만들어진다.

이 성질을 이용하여 플라스미드 카피 수의 증폭을 행한 것이다. pUC계의 플라스미드는 카피 수가 많으므로 통상은 이러한 조작 없이도 충분한 양의 플라스미드를 얻을 수 있다.

[준비] 클로람페니콜 용액-68mg/ml 에탄올 용액.

STE완충액-0.1M-NaCl-10mM 트리스-염산(pH7.8)-1mM-EDTA.

취화에치지움 용액-10mg/ml 수용액

a. 배양법 ① 대장균 콜로니를 5ml LB 배지(적당한 항생물질을 함유한다./이하 전부에)에 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양한다.

② 배양액 0.2ml를 50ml LB 배지에 식균하여 30℃에서 OD600=0.6전후까지 배양한다.

③ 미리 30℃로 만든 배양액 1,000ml에 식균한다. 이것을 OD600이 0.4로 될 때까지 30℃에서 배양한다.

④ 2.5ml의 클로람페니콜용액을 가하고, 12∼16시간 30℃에서 배양한다.

⑤ 4,000×g, 10분간 4℃에서 원심 집균하고, 빙냉한 STE 100ml로 세정한다.

b. 알카리로 용균 ① 균체를 20ml의 리조치움 용액에 현탁하여 실온에서 5분간 정치

② 알카리 SDS용액 40ml를 가하여 수회 튜브를 반전시켜, 빙중에서 10분간 정치.

③ 빙냉초산 칼륨용액 30ml를 가하여 수화 튜브를 반전시키고, 10분간 빙중에 정치

④ 12,000×g, 4℃, 30분 원심.

⑤ 상청을 새로운 튜브에 옮기고 0.6용량의 이소프로필을 가하여 잘 혼합하고, 실온에서 15분간 정치

⑥ 12,000×g, 실온, 30분의 원심으로 DNA를 회수.

⑦ 70%의 에탄올로 세정하여 진공건조 후 TE8ml에 용해한다.

c. 평형밀도구배 원심에 의한 DNA의 분리·정제 ① DNA용액의 액량을 측정

② 정확히 DNA용액 1ml당 1g의 염화세슘을 가하여, 녹을 때까지 충분히 섞는다.

③ 염화세슘을 가한 DNA용액 10ml당 취화 에치지움 0.8ml를 가한다.

④ 45,000rpm, 36시간, 20℃에서 원심.

⑤ 원심관에 암소에서 자외선을 조사하면 2개의 橙色의 밴드가 관찰된다.(카피수가 많은 플라스미드는 자외선 조사 없이도, 붉은 밴드로써 육안으로 볼 수 있다.) 위의 밴드는 線狀의 DNA와 닛크가 들어있는 環狀플라스미드이며 아래의 밴드는 閉環狀플라스미드 DNA(cccDNA)이다.

⑥ 아래의 밴드를 주사기로 뽑아낸다.

⑦ 동량의 수포화이소부탄올을 가하여, 두층을 혼화한다.

⑧ 1,500×g, 3분간 실온에서 원심.

⑨ 상층을 버리고(하층이 필요), 취화 에치지움의 색이 없어질 때까지 ⑦,⑧의 조작을 반복한다.

⑩ 수충(水層)을 채취하고, 2배량의 滅菌水, 6배량의 에탄올을 가하여 플라스미드를 침전시켜 회수 한다.(-20℃, 이하로 냉각해서는 안된다.)

(3) 염색체 DNA의 조제법

[준비] STEP용액-0.5% SDS, 50mM 트리스-염산완충액(pH7.5), 0.4M-EDTA(실온보존), Proteinase K 1mg/ml(사용전에 가한다.)

페놀용액-페놀(아미노산 분석용 그레이드)에 1M 트리스-염산완충액(pH8.0)을 가하여 포화, 4℃에서 보존.

RNase A 보존액-10mM 트리스-염산완충액, 15mM-NaCl, RNaseA 10mg/ml

[수순]① 1콜로니를 100ml LB 배지에 식균하여 30℃에서 하룻밤 배양.

② 2,000×g, 20분간 원심, 집균.

③ 균체를 TE 5ml에 현탁하여 -20℃에서 동결시킨다.

④ 동결균체에 리조치움 용액 0.5ml를 가하여 실온수중에 녹인다. 녹이고 나서 빙중에 45분 정치

⑤ STEP 1ml를 가하여, 때때로 조용히 혼합시키면서 50℃, 60분간 데운다.

⑥ 페놀용액 6ml를 가하여, 3분간 손으로 충분히 섞는다.

⑦ 1,000×g, 15분 원심하여 2층으로 나눈다. DNA는 상층에 온다.

⑧ 중간층의 물질이 섞이지 않도록 상층을 새로운 튜브에 옮긴다. 만일, 섞였을 경우 ⑥,⑦의 조작을 반복한다.(DNA 농도가 높으면 점성이 높고, 중간층이 섞이지 않도록 조작하는 것은 거의 불가능하다. 그 경우는 최초로부터 ⑥,⑦의 조작을 반복할 작정으로 조작을 한다.)

⑨ 1/10용량의 3M 초산 나트륨을 가하고, 조용히 서는다.

⑩ 2배 용량의 에탄올을 가하여, 반전하고, DNA, RNA를 침전시킨다.

⑪ 유리봉(앞을 막은 파스츨 피펫이 편리)으로 線狀의 침전을 감아낸다. 충분히 알콜을 제거하고, 5ml의 500mM 트리스-염산완충액(pH7.5), 1mM-EDTA, 200□/ml RNaseA의 수용액에 넣는다.

⑫ 침전이 용해할 때 까지 4℃에서 충분히 진탕한다.

⑬ 혹시 DNA가 용해하지 않은 경우는 필요에 따라서 완충액을 가한다.

⑭ 동량의 클로로포름을 가하여 수시간 손으로 반전시키면서 섞는다.

⑮ 1,000×g, 15분 원심하여 2층으로 나눈다.

16. 상층을 새로운 튜브에 옮기고 0.1용량의 초산나트륨 용액, 2용량의 에탄올을 가하여, 반전시켜 섞는다. DNA는 백색 線狀이 된다.

17. 유리봉으로 DNA를 감아내고, 1mM-EDTA를 함유한 50mM 트리스-염산완충액(pH7.5) 2ml에 완전히 용해시키고, 필요하면 완충액을 가한다. 4℃에서 보존

(4) RNase 처리

DNA용액에 함유된 RNA를 제거하기 위해 100℃, 15분의 처리로 DNAase를 失活시킨 RNaseA(0.5mg/ml, -20℃에 보존)를 10□/ml의 농도가 되도록 가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트한다.

(5) 에탄올 침전

DNA의 농축, 정제, 완충액의 교환등을 위해 행한다. DNA용액에 0.1배량의 3M 초산나트륨(pH5.2)을 가한 후, 2배량의 에탄올을 가하여 혼화하게 섞고, 10분이상 -80℃(또는 -20℃에서 수시간)에서 정치한다.

다음으로 12,000rpm, 10분, 4℃에서 원심하고, 침전에 -20℃의 70% 에탄올을 가하고 다시 원심하여 잔존하는 염 등을 제거한다. 필요하면, 이 세정을 2∼3회 행한다. 그리고, 침전을 진공건조하여 적당량의 TE에 용해시키고, 4℃ 또는 -80℃에서 보존한다.

(6) DNA의 간이 정량법

a. 흡광도법 DNA용액의 260nm에 있어서 흡광도를 측정한다. 2개 사슬 DNA에서는 50□/ml, 1개 사슬 DNA에서는 40□/ml일 때의 흡광도는 약 1이다.

순도가 높은 DNA에서는 260nm와 280nm에 있어서 흡광도 비가 약1.8이다. 측정치가 이 치보다도 낮을 때에는 , 그 DNA용액에는 단백질이 혼재되어 있을 가능성이 있다.

b. 형광법 취화에치움 결합 DNA의 형광강도로부터 DNA농도를 추정한다. 취화에치움을 함유한 아가로스겔에 DNA 검체액의 5□를 스폿트하고, 농도의 대조용으로써(10∼80□)의 DNA용액 5□를 스폿트하고 건조시킨다. 그리고 자외선을 조사하고 형광강도를 관측하여 비교함으로써 검체 DNA농도를 결정한다.

(7) 아가로스겔 전기영동

아가로스겔 전기영동에 의해 제한효소로 절단 후 DNA의 영동패턴을 관찰하고, DNA 단편의 분획을 한다.

사용하는 겔 농도는 분석하는 DNA단편의 길이, 목적으로하는 분리의 정확성에 의해 달라진다. 보통의 경우, 0.7∼1.0%의 농도가 사용된다. 10kb이상의 DNA단편의 분리에는 0.5%이하, 0.5kb 이하의 경우에는 1.2∼1.5%의 겔을 이용하면 좋다.

[전기영동장치] 각 社로부터 시판되고 있지만 필자등은 다음의 것을 사용하였다.

Mupid-2(코스모·바이오) 초소형(겔사이즈 10×6cm, 5×6cm), TAKARA HE-11형 (12×14cm, ?酒造)

아가로스-Agarose H 14「TAKARA」

[완충액] 영동용 완충액-TBE, 89mM-Tris-base, 89mM 붕산, 2mM-EDTA

[샘플완충액] 0.25% 브로모페놀블루, 0.25% 키시렌시아놀, 40%(w/v)슈크로스 수용액

트란스일루미네이터 및 카메라 등으로 필자등이 사용한 것은 다음과 같다.

TM-20 transilluminator 302nm(후나코시), Model UVM-57 302nm(핸디형, 후나코시)

카메라-MAMIYA professional

필름-폴라로이드·코타레스·인스턴트·팟크필름 667등

[아가로스 용액] 아가로스를 영동 완충액에 가하고, 전자레인지로 녹이고, 취화에치지움을 소량 가해 고무를 꽃아서 아가로스겔을 작성한다. 영동조에 TBE완충액을 넣고, 고무를 빼낸 아가로스겔을 만들고, 웰을 TBE로 세정하고, 양극측에 소량의 취화에치움을 가한다. 그리고, DNA용액 : 샘플완충액을 5:1의 비율로 혼합하고 웰에 조용히 주입한다. 50∼100v의 정전압으로 영동을 하고 종료후 암소에서 트란스일루미네이터에 의한 자외선의 조사에 의해, DNA의 밴드를 관찰하여 필요하면 사진을 찍는다. 사이즈 마카로써 □DNA의 HindⅢ 분해물(□HindⅢ)이 일반적으로 사용된다.

(8) 겔로부터의 DNA의 회수

a. DEAE여지에 의한 방법

[준비] Whatman DE 81-cellulose paper

용출완충액-20mM 트리스-염산(pH8.0), 2mM-EDTA, 1.5M-NaCl

[수순] DEAE여지를 2.5M-NaCl 용액에 4℃에서 2시간 담근 후에 멸균수로 3회 세정하고, TBE에 5분간 담그는 전처리를 한다. DNA시료를 아가로스겔 전기영동한 후, 트란스일루미네이터로 분획하는 위치를 확인하여 영동방향과 직각으로 겔에 갈라넣은 것을 넣고 전처리를 한 여지를 거기에 말아 끼워 넣는다. 영동을 재개하여 목적으로 하는 DNA가 모두 여지에 옮겨지면 영동을 멈춘다. 살짝 겔로부터 여지를 빼낸다.

이 여지를 500□튜브(미리 낮게 주사침으로 구멍을 뚫고, 거기에 실리코나이즈한 글라스울을 채운다)에 넣고, 이 튜브를 1.5□의 튜브에 넣고, 용출 완충액 200□를 가해 37℃, 1시간 보온한다. 원심 후, 1.5□튜브에 옮긴 용액을 회수한다(이 조작을 2, 3회 반복한다). 페놀추출, 水飽和 n-부탄올 추출 후, 에탄올 침전하고, 진공건조 하여 TE에 용해한다.

b. 전기영동적으로 겔로부터 DNA를 회수하는 방법

우리들은 IBI社 製의 장치를 이용하여, 높은 회수율을 얻는 것으로 그 방법을 소개한다.

[준비] 영동완충액A-20mM트리스-염산완충액, 0.2mM-EDTA,5mM-NaCl,

고염완충액-3M초산나트륨용액에 브로모페놀블루를 가한다.

용출장치-Model UEA, Unidirectional electroelutor(alalyatical), International Biotechnologies Inc., New Haven conn., U.S.A.

[수순] 아가로스겔 전기영동 종료 후, 목적으로 하는 DNA밴드를 겔로부터 잘라내고, 영동 완충액A에 조금 담그고 나서 Model UEA의 플랫폼에 올린다. 높은 회수율을 얻기 위해서, 겔의 두께는 2mm이하가 좋다. 그리고 전기영동액 A를 겔 절편과 같게 하던지, 또는 바로 아래의 높이까지 넣는다. 그것보다도 높으면 효율은 내려간다.

그후, V-채널의 기포를 제거하고, 앞의 미세한 튜브를 장치한 피펫만을 이용하여 고염 완충액 100□를 주의깊게 주입한다. 그후, 이 장치는 수평이며, 고염완충액의 경계면이 흐트러지면 안 된다. 밸브의 조정으로 음극과 양극의 완충액을 차단한 후에, 125V의 정전압으로 추출을 한다. DNA는 겔로부터 추출되어, V-채널에 고인다. 때때로 트란스일루미네이터로 겔중에 잔존하는 DNA량을 확인한다.

추출 종료 후, 전원을 끊고, V-채널로부터 피펫만을 이용하여 고염완충액과 함께 400□를 뽑아낸다. 추출시간은 50분 이내로 하지만, 그래도 끝나지 않을 때에는, 다시 고염완충액을 빼내고 나서, 다시 추출을 한다. 이 400□의 샘플에 에탄올 1□를 가하여 에탄올 침전을 하고, DNA를 추출한다.

(9) 제한효소에 의한 DNA의 절단

보통 0.2∼1□의 DNA의 절단에서는 반응액량 20∼50□로 할 때가 많다. 반응액 20□의 경우, DNA용액과 멸균수를 튜브내에서 혼합하여 18□로 하고, 사용하는 제한효소용의 10배농도 완충액 2□를 가하여 혼합한다. SmaⅠ의 반응은 30℃에서 한다. ?速法에 의해 조제한 플라스미드는 희석이 충분하지 않으면, 제한효소에 의한 절단이 일어나지 않는 것이 많다.

(10) BAP처리

벡타 DNA에, 제한효소로 절단한 DNA단편을 삽입할 때 제한효소로 절단 후의 DNA의 5`말단 인산기를 BAP(bacterial alkaline phosphatase)를 이용하여 제거하는 것에 의해, 벡타 DNA의 셀프라이게이션을 막는다.

표-13.1 10×Digestion buffer

buffer	Tris·HCl (pH7.5)	NaCl	MgCl2	DTT*
High Medium Low	50mM 10mM 10mM	100mM 50mM 10mM	10mM 10mM	1mM 1mM 1mM
	Tris·HCl (pH8.0)	KCl	MgCl2	2-mercapto ethanol
SmaⅠ	10mM	20mM	7mM	7mM

* : dithiothreitol

DNA용액(5`말단농도 5∼20pmol) 180□와, 10×BAP완충액(0.5M 트리스-염산(pH8.0) 20□를 혼합하고, BAP를 0.4유니트(5□) 가하여, 60℃(평골말단 또는 3`돌출말단) 또는 37℃(5`돌출말단)에서 1시간 반응시킨다. 그 후, BAP를 제거하기 위해 페놀 추출을 4회, 클로로포름 추출을 1회하고, 에탄올 침전에의해 DNA를 회수한다.

(11) 라이게이션

벡타DNA와 DNA단편의 용액을 적당한 비율(단 DNA량에서, 1:3=150ng:450ng)로 혼합하고, 액량이 많으면 에탄올 침전으로 농축하고 멸균수로 18□로 한다. 거기에 10×라이게이션 완충액 2□를 혼합하고, T4 DNA ligase를 적당량(1□)가해, 16℃에서 하룻밤 인큐베이트한다.

(12)형질전환법

효율좋은 형질전환은 組替의 DNA 실험에 있어서 매우 중요하다. 대장균을 Ca2+의 존재하에 놓으면, 外末性 DNA를 세포내에 취입하여, 여러 가지 Competent한 상태로 된다.

[수순] ①싱글 콜로니를 LB배지에 식균하고, 37℃에서 하룻밤 배양하고, 이 배양액 1ml를 100ml의 LB배지에 식균하여 약 5×107세포/ml가 될 때까지 37℃에서 배양한다.(rec+株<JM109>는 OD550=0.2, rec-<HB101>은 OD550=0.5, 2∼4시간 걸린다.)

② 배양액을 10분 빙냉하고, 4,000×g, 5분, 4℃에서 원심한다.

③ 상청을 버리고 최초의 배양액의 1/2용량의 빙냉한 멸균제인 50mM-CaCl2, 10mM 트리스-염산(pH8.0)에 현탁한다.

④ 빙중에 15분 방치하고, 4,000×g, 4℃, 5분간 원심한다.

⑤ 상청을 버리고 최초 배양액의 1/15용량의 빙냉한 멸균체인 50mM-CaCl2-10mM 트리스-염산(pH8.0)에 현탁한다. 미리 냉각한 튜브에 0.2ml씩 분주하여 4℃에서 12∼24시간 방치한다. 이 사이에 형질전환 효율은 4∼6배로 된다.

⑥ 라이게이션 완충액 또는 TE에 용해한 DNA(40ng, 100□까지)의 상기 콤피텐트셀을 혼합하고, 30분 빙중에 냉각한다. 다음에 42℃, 2분 인큐베이트하고(이 때 DNA가 세포내에 도입된다.) 각각의 튜브에 1ml의 LB배지를 가해, 37℃에서 1시간 인큐베이트한다.(이 때, 약제耐性이 발현한다.)그리고 여러단계로 희석하고, 적당한 항생물질을 함유한 플레이트에 도말하고 33℃에서 하룻밤 배양한다. 생육하는 콜로니가 형질전환체의 클론이다.

상기의 방법(Mandel and Higa)과 E.Coli HB101을 이용할 경우 pBR322 DNA 1□에서 105∼107의 형질전환체가 얻어진다.

하기의 Hanahan의 개량법에 의하면 2∼7×108의 형질전환체가 얻어진다.

[준비] SOB배지-2% 박토트립톤, 0.5% 이스트엑트렉스, 10mM-NaCl, 2.5mM-KCl, 10mM-MgCl2, 10mM-MgSO4.

SOC배지-SOB배지에 20mM의 글루코스를 가한 것.

[수순] ① SOB 한천배지에 도말한 신선한 2∼3mm의 직경의 콜로니 수 개를 1ml의 SOB 배지에 볼텍스 믹서로 현탁한다. 10ml의 배지당 1콜로니를 이용한다. 도말은 냉동균체, 혹은 신선한 천자(穿刺) 배양으로부터, 액체배양을 시작한다. 16∼20시간전에 행하는 것이 제일 좋다.

② SOB 배지를 함유한 삼각플라스크에 이식한다. 배지와 플라스크의 용량비를 1:10에서 1:30으로 한다.(30∼100ml/1,000ml)

③ 4∼7×107세포/ml로 될 때까지 37℃에서 천천히 진탕 배양한다.

④ 50ml의 폴리프로필렌제 원심관에 집균하고 10∼15분 빙냉한다.

⑤ 750∼1,000×g, 4℃에서 12∼15분 원심한다. 페이퍼 타월 위에서 튜브를 거꾸로 해서 액을 완전히 빼내고, 관입구를 페이퍼타월에 강하게 때려서 액을 빼낸다. 그래도 나오지 않는 액적은 피펫으로 취한다.

표-13.2 TFB(표준형질전환 완충액)

화합물	양/liter	최종농도
KCl(초순품)	7.4g	100mM
MnCl·4H2O	8.9g	45mM
CaCl2·2H2O	1.5g	10mM
HACoCl3	0.8g	3mM
K-MES	20ml of 0.5M Stock(pH6.3)	10mM

K-MES 조제 : 농 KOH를 이용하여 0.5M-MES(2[N-morphino] ethanesulphonic acid)를 pH6.3으로 조절한다. 이어서 0.22□ 막으로 무균여과하고, 일정량씩 나누어서 -20℃에서 보존한다. 0.5M-MES 보존액과, 가능한한 고도의 순수를 이용하여 10mM-K-MES를 조제한다. 염은 고형물로써 가하고, 0.22□의 미리 행군 막을 통하여 여과한다. 일정량을 멸균 플라스크에 넣고 4℃에서 보존한다.(약 1년 안정).

표-13-3 DnD 용액

화합물	量/10ml 최종용액	최종농도
DTT*1	1.53g	1M
DMSO*2	9ml	90%(v/v)
초산칼륨	1M 보존액(pH7.5) 100□	10mM

*1 : dithiothreitol  *2 : dimethylsulfoxide

⑥ 세포를 배양액의 1/3용량의 TFB(표-13.2)에 가볍게 볼텍스믹서로 현탁하고 10∼15분 빙냉한다.

⑦ ⑤와 같이 세포를 펠렛트화하여 완전히 액을 제거한다.

⑧ 세포를 배양액의 1/12.5 용량의 TFB에 재현탁한다. 이것은 2.5ml의 배양액의 균체를 200□의 TFB에 현탁한 것이 된다.

⑨ 3.5%(v/v)가 되도록 DnD(표-13.3)를 가한다. 즉, 200□의 세포현탁액에 7□를 가한다. DnD를 세포현탁액의 한가운데로 흡입하고, 곧바로 수초간 튜브를 돌려서 혼합한다. 10분간 빙냉한다.

⑩ ⑨와 같이 최종 7%가 되도록 DnD를 다시 가한다. 10∼20분 빙냉한다.

⑪ 미리 냉각한 튜브에 210□씩 분주(分注)한다.

⑫ 20□ 이하의 DNA 용액을 넣고 혼합한다. 튜브를 20∼40분 빙냉한다.

⑬ 튜브를 42℃의 온수에 90초 담그고, 두두려준다. 두드리는것(힛트쇼크)을 멈추고 튜브를 얼음에 되돌려 놓고, 2분간 냉각한다.

⑭ 각 튜브에 80□의 SOC를 가한다. 37℃에서 30∼60분 가볍게 진탕하면서 인큐베이트한다. 형질전환체를 선택하기위해 적당한 항생물질을 함유한 한천 플레이트에 도말한다.

注 Hanabann의 방법을 더 개량한 방법으로 만들어진 세포가 Competent Cells로써 시판되고 있다. 그것을 이용할 경우는 첨부되어 있는 설명서에 따른다.

13.5 키티나제 클로닝의 선택

그림-13.1에 클로닝의 방법의 개략을 나타내었다.

B.circulans WL-12              벡타플라스미드

염색체 DNA

제한효소에 의한 분해           제한효소에 의한 절단

아가로스겔 전기영동            BAP처리

DNA단편                      개환 플라스미드

라이게이션

↓

형질전환(수용균 E.Coli HB101)

↓

암피시린을 함유한 LB한천배지

↓

콜로이달키틴과 암피시린을 함유한 한천배지

↓

용해존에 둘러 쌓인 콜로니의 선택

그림-13.1 클로닝법의 개략

(1) 라이브러리 작성을 위한 DNA단편의 획득

플라스미드 DNA에 조입(組□)을 위한 목적 사이즈(2∼10kb)의 DNA단편을 얻기 위해, 제한효소(EcoRI, HindⅢ, PstⅠ)로 완전분해 및 HindⅢ, Sau3AI로 부분분해한 염색체 DNA를 하룻밤 전기영동하고, 그 겔로부터 2∼10kbeks편을 DEAE 여지로 회수 정제 하였다.

이와 같이 여러 가지 제한효소 및 분해조건을 이용한 것은 목적유전자가 특정한 제한효소에 의해 절단을 받는 것을 고려한 것이다. 또한 6염기 인식의 효소에의한 부분분해에서는 목적 유전자를 함유한 DNA단편이 길어질 가능성이 있어서 4염기 인식의 Sau3A에 의한 부분분해도 병용하였다.

(2) B.circulans WL-12의 유전자 라이브러리의 작성

벡타로써 pBR 322, pKK 223-3, pUC 19를 이용하였다. 이들 플라스미드를 제한 효소로 절단 BAP 처리를 하고, 한편, B.circulans WL-12의 염색체 단편(2∼10kb)을 가 제한효소로 절단하고, T4DNA리가제를 이용하여 라이게이션을 하였다.

150ng-pUC 19, pBR 322, pKK 223-3.

450ng-염색체 DNA

組換플라스미드를 가진 형질전환체는 먼저 100□/ml Amp를 함유한 LB배지에서 선택하였다. 이 플레이트에 나타난 콜로니를 멸균한 이쑤시개로 100□/ml Amp, 0.4%(w/v) 콜로이달 키틴을 함유한 LB배지위에 옮겨 키티나제 유전자를 가진 클론을 용해 존의 형성으로 선택하였다.

키티나젠느 각각 기질특이성이 다르며, 글리콜 키틴을 함유한 플레이트를 이용하는 편이 보다 고감도로 클론을 검출할 수 있는 경우도 많다. 우리들의 경우도 chiC, chiB의 클론은 글리콜 키틴 플레이트를 이용하여 검출하였다. 본 실험에서는 pKK 223-3과 HindⅢ로 부분분해한 DNA에 의해 얻어진 형질전환체 약2,000을, 콜로이달 키틴 플레이트에 옮겨 2일간 배양하고, 그 중 1개의 형질전환체가 용해존을 형성하였다. 이 플라스미드는 pKK223-3의 HindⅢ부위에 4.0kb의 B.circulans WLL-12 DNA 단편이 삽입되어 있다는 것이 판명되었다. 이 4.0kb의 삽입단편을 pUC 19의 HindⅢ부위에 섭클론 했을 때 키티나제 활성을 발현하였다.

이 플라스미드를 pHT 002로 명명하였다. 또한 반대방향으로 삽입된 조환□(pHT 002 R)도 활성을 발현했으므로, 클론화된 4.0kbeks편에 함유된 키티나제 유전자는 그 자체의 프로모터로 발현한다는 것이 밝혀졌다.

13.6 염기배열의 결정

단백질의 구조와 기능의 해명에는 아미노산 배열을 아는 것이 필순이다. 최근에는 핵산구조 해석기술이 진보하여, 유전자를 클로닝하는 것이 가능하면, 그 염기배열을 결정하고, 번역생산물인 단백질의 일차구조를 추정한느것은 비교적 용이하다. 염기배열 및 단백질의 일차구조가 결정되면 컴퓨터해석에 의해 유전자 및 단백질의 구조나 기능에 관한 여러 가지 정보를 얻을 수 있다.

DNA염기배열 결정법에는 원리적으로 다른 2가지의 방법이 있다. 화학적 분해법(Maxam-Gilbert)과 다이데옥시법(체인 타미네이션 법, 효소법, Sanger법 등으로도 불려진다.)이다. 여기에서는 주로 필자등이 이용한 다이데옥시법에 대해서 서술하는 것으로 한다. 또한 다이데옥시법은 M13mprP의 일체쇄 DNA벡타를 이용하여 행하는 경우가 일반적이지만, 변성된 pUCrP의 벡타를 이용하는것도 가능하며, 우리들도 그 방법을 이용하였다.

(1) 시퀜스용 딜레이션 뮤탄트의 작성

필자등은 이 목적으로 TAKARA 키로시퀜스용 딜레이션 킷트를 이용하였다. 먼저 서술한 pUC 19의 멀티 클로닝사이트에 클로닝된 4kb의 DNA(pHT 002, pHT 002R)의 염기배열을 결정하기 위해, 시퀜싱프라이머를 아닐링(인조물감)시킨 경우의 말단으로부터 순차 딜레이션을 도입한 플라스미드를 작성하였다.

[킷트의 내용] 엑소Ⅲ완충액-50mM 트리스-염산(pH8.0), 100mM-NaCl, 5mM-MgCl2, 10mM-2-멜캅토 에탄올.

망빈누클레아제 완충액-40mM 초산나트륨(pH4.5), 100mM-NaCl, 2mM-ZnCl2, 10% 글리세롤

망빈누클레아제(25 유니트/□)

Klenow완충액-7mM 트리스-염산(pH7.5), 0.1mM-EDTA, 20mM-NaCl, 7mM-MgCl2, 0.1M-dATP, 0.1mM-dGTP, o.1mM-dCTP, 0.1mM-dTTP.

Kelenow 효소(2 유니트/□)

라이게이션 용액A

라이게이션 용액B

[킷트를 이용하기 전에] MB mp 벡타 및 pUC계 플라스미드의 멀티클로닝사이트에 염기배열을 결정하고자 DNA를 클로닝하고, 그 cccDNA를 조제한다. 그리고, 인사이트 DNA의 프라이머를 아닐링 시킨것의 말단으로부터 순차 딜레이션을 도입한 플라스미드을 얻기위해, 프라이머의 아닐링 사이트와 인사이트 DNA와의 사이를 2가지의 제한효소(임시로 인사이트 DNA측을 a, 프라이머의 아닐링측을 b로 한다.)로 절단한다. 이 때, a, b 양 효소모두 인사이트 DNA에 그 제한효소 사이트가 있으면 안된다. 또한, a의 효소(인사이트 DNA측)는 DNA를 절단한 후 5`가 돌출하든지, 또는 브란트엔드로 되는것(EcoRI, SmaI, XmaI, BamHI, XbaI, SalI, AccI, HincⅡ, HindⅢ 등), 그래서, b의 효소는 3`말단이 돌출하는것(SacI, KpnI, PstI, SphI 등)으로 절단한다.

[수순] ① 염기배열을 결정하고자(또는 단독으로 딜레이션을 도입하려고) DNA가 클론화된 MB RFDNA 또는 pUC계 플라스미드(이 실험에서는 pHT 002 및 pHT 002R)의 cccDNA를 각각 1∼2pmol(5∼10□) 준비한다.

② 인사이트 DNA측을 5`말단이 돌출하는 제한효소 a(이 실험에서는 Xbal)로 절단, 프라이머의 아닐링측을 3`말단이 돌출하는 제한효소 b(이 실험에서는 KpnI)로 절단한다.

③ 동량의 TE 포화페놀로 1회 추출한다. 원심하여 상청을 따로 튜브에 옮기고, 동량의 클로로포름-이소아밀알콜(24:1, v/v)을 가해 1회 추출한다.

④ 원심하여 상청을 별도의 튜브에 옮기고, 2.5배량의 에탄올을 가해 원심하여 침전을 회수한다. 70%에탄올로 세정 후, 진공건조한다.

⑤ ④에서 얻어진 DNA를 100□의 엑소Ⅲ완충액에 용해 시킨다.

⑥ 별도의 튜브에 망빈누클레아제 완충액을 100□ 넣는다.

⑦ ⑤의 DNA용액에 1□(180유니트)의 엑소누클레아제Ⅲ을 가하고 볼텍스로 교반하고, 37℃에서 인큐베이트한다. 그리고, 1분에 10□씩 샘플링하고, 반응을 멈추기 위해 ⑥을 사용한 100□의 망빈누클레아제 완충액 중에 순차적으로 넣는다.(엑소Ⅲssm 2本鎖 DNA부분을 인식하여, 그 3`측으로부터 5`방향으로 분해해가는 특성을 가지고 있다. 즉, 5`측이 돌출한 말단 또는 브랜트로 절단된 말단 3`측으로부터 분해가 진행된다. 게다가 3`측이 돌출한 말단의 분해는 일어나지 않는다.)

상기의 조건에서 1분간에 약 300염기 정도 소비되어 간다.

⑧ 65℃, 5분간 인큐베이트하여 엑소누클레아제Ⅲ을 失活시켜 37℃로 졸려 놓는다.

⑨ 2□(50유니트)의 망빈누클레아제를 가한다.

⑩ 37℃, 30∼60분 인큐베이트한다.

⑪ ③, ④의 조작을 한다.

⑫ ⑪에서 얻은 DNA를 50□의 Klenow완충액에 용해시킨다.

⑬ 1□(2유니트)의 Klenow효소를 가하여 37℃, 15분 인큐베이트한다.*1

⑭ 2.5배량의 에탄올을 가하고 원심하여 침전을 회수한다. 70% 에탄올로 세정 후, 진공건조 한다.

⑮ ⑭에서 얻은 DNA를 40□의 TE완충액에 녹인다.

(16) 상기 DNA용액 5∼10□을 100□의 라이게이션 용액A에 가한다.

(17) 12□의 라이게이션 용액B를 가하고, 볼텍스로 교반한다.

(18) 16℃에서 하룻밤 반응시킨다.*2

(19) ⑭의 조작을 한다.

(20) (19)에서 얻은 DNA침전을 수 유니트의 제한효소 a로 절단한 그 자체 콤피텐트셀(200□이상)에 형질전환 시킨다.*3

*1 : 망빈누클레아제에 의해 DNa의 말단은 대부분 브란트엔드로 되지만, Klenowgyth에 의한 완전한 말단 修復에 의해 후의 라이게이션 효율을 더욱 올릴수 있다.

*2 : 라이게이션A, B의 반응시간은 수시간으로도 좋지만, 하룻밤 반응시킴으로써 라이게이션 효율을 더욱 올릴 수 있다.

*3 : 여기에서 제한효소 a를 작용시키는 것은, ②의 과정에서 완전히 절단 시키지 않은 플라스미드를 내리기 위함이며, 필순의 조작이다.

콜로니를 각각(pHT 002, pHT 002R의 딜레이션뮤탄트) 250개 정도 취하여, 5ml의 LB배지에 배양하고, ?速法으로 플라스미드를 정제한다. 그리고 적당한 제한 효소로 절단하고, 아가로스겔에서 전기영동하고, DNA의 사이즈를 조사한다. 약 200염기 정도에서 딜레이션이 도입된 클론을 선택하였다. 이 클론으로부터 템플레이트 DNA를 조제하고, 염기배열의 결정을 행한다.

[다이데옥시 법]

DNA염기배열의 결정은 다이데옥시 DNA 염기배열 결정법과 편리한 一本鎖 DNA 클로닝 벡타의 구축에 의해 급속한 진보를 나타내었다. 다이데옥시법은 일체쇄 DNA의 주형(거푸집)을 이용한 in vitro에서 DNA 폴리머라제를 이용하여 相補的 DNA쇄를 합성시킨다. DNA쇄의 합성은 올리고누클레오티드의 프라이머가 주형 DNA와 아닐하는 부위로부터 시작한다. 합성반응은 DNA쇄의 신장(伸張)을 정지시키는 누클레오티드아나로그를 넣어줌으로써 정지한다. 신장 정지누클레오티으아나로그는 2`, 3`dideoxynucleoside 5`-triphosphates(ddNTPs)이다.

이것들은 DNA쇄의 신장에 필요한 3`OH를 부순다. 4종류의 dNTP와 4종류의 ddNTP중의 1종류를 함유한 액중에서 반응을 행하면, 중합반응은 ddNTP가 취입되는 시점에서 정지한다. 다른 4종의 ddNTO에서의 각각의 실험으로 염기배열에 관한 완전한 정보가 얻어진다. 이소토프라벨한 누클레오티드를 넣어두면, 고분해능전기영동 후, 오토라디로그라피에 의해, 라벨된 각종 길이의 DNA 단편이 검출될 수 있다.

(2) 플라스미드 DNA의 조제

① 싱글콜로니를 5ml LB배지에서 30℃, 하룻밤 배양하고, 1.5ml의 튜브에 원심으로 집균한다.

② 상청을 완전히 제거하고, 60□의 50mM 글루코스, 25mM 트리스-염산(pH8.0), 10mM-EDTA에 현탁시키고, 40□의 10mg/ml 리조치움용액(사용직전에 조제)을 가해 천천히 혼합하고, 실온에서 5분간 방치한다.

③ 200□의 0.2N-NaOH-1%SDS 용액을 가하여 천천히 혼합하고, 빙중에서 5분간 방치(시간엄수)한다.

④ 150□의 5M 초산칼륨용액을 가하여 천천히 혼합하고 빙중에서 적어도 5분간 방치한다.

⑤ 12,000rpm, 10분간, 4℃로 원심한다.

⑥ 상청을 별도의 튜브에 옮기고, 페놀추출, 클로로포름추출, 에탄올 침전을 행한다.

⑦ 펠렛트를 50□의 TE(pH8.0)에 용해시켜, 10□/ml 농도가 되도록 RNaseA(0.5mg/ml)용액을 1□ 가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트한다.

⑧ 20% PEG 6,000-2.5M-NaCl을 30□가하고, 잘 혼합하여 빙중에서 적어도 1시간 방치한다.

⑨ 12,000rpm, 5분간의 원심으로 상청을 버리고 70% 에탄올로 린스하여 진공건조한다.

⑩ 펠렛트를 50□의 TE(pH8.0)에 용해하고, 大□의 DNA농도를 예측한다.(템플레이트에는 3∼5□의 플라스미드를 사용한다.)

(3) 플라스미드의 알카리 변성

① 상기 DNA용액(50□)에 가능한 한 새로운 2N-NaOH 5.6□를 가하여 실온에 5분간 방치한다.

② 5M 초산 암모니아 22.2□를 가하고, 에탄올 278□를 가해 -80℃에서 10분이상 방치 후, 12,000rpm, 5분간 원심한다.

③ 상청을 버리고 70% 에탄올로 세정 후, 진공건조 한다.

(4) 다이데옥시 법

상기에서 조제한 플라스미드 DNA의 염기배열을 다이데옥시법에 의해 결정하였다. 이 방법에 의한 염기배열 결정에 편리한 시퀜싱킷트가 각 회사로부터 시판되고 있다. 필자등은 SequenaseTM(United States Biochemical Corporation, TOYOBO Co. ltd)을 사용하였다. SequenaseTM을 이용한 염기배열 결정법은 ddNTP를 함유하지 않은 반응계로 아이소토프 표준화와 相補鎖伸張 반응과, ddNTP를 함유한 계에서의 상보쇄신장 반응과 정지반응의 이단계 반응이다. SequenaseTM version 1.0은 T7 DNA 폴리머라제를 부분적으로 수식하여, DNA 합성능은 파손시키지 않고 3`→5` 엑소누클레아제 활성만을 저감한 다이데옥시법 염기배열 결정에 적당한 효소로써 개발된 것이다.

[□-35S]-dAPP용의 SequenaseTM for labeled dATP와 [□-35S]-dCTP용의 SequenaseTM for labeled dCTP가 있지만, 여기에서는 SequenaseTM for labeled dATP에서의 방법을 나타낸다.

a. 아닐링

① 원심 튜브에 하기의 것을 넣는다.

프라이머 1□, 반응완충액 2□(약1□, pUC 18, 19의 경우는 3□) 7□, 최종용량은 반드시 10□로 할 것.

② 뚜껑을 한 튜브를 65℃, 2분간 가열하고, 30분간 충분하게 실온까지 내린다. 온도가 30℃ 이하가 되면 아닐링은 종료된다. 튜브를 빙냉한다. 아닐링한 주형은 4시간 이내에 사용하지 않으면 안된다.

b. 아이소토프 표식화

① 표준적 반응에서는 Labeling Mix를 멸균한 증류수로 5배로 희석한다.

② SequenaseTM 효소를 빙냉한 효소 희석용 완충액으로 1:8로 희석한다. 필요한 효소량을 사용 직전에 희석한다.

③ 아닐 된 주형 프라이머에 다음의 것을 가한다.

주형 프라이머(전술의 물질) 10.0□, 0.1M-DTT 1.0□, 희석한 labeling Mix 2.0□, [□-35S]-dATP(10□Ci/□) 0.5□, 희석한 SequenaseTM 2.0□(최후에 가한다.) 혼합하고 37℃에서 5분간 실온에서 반응시킨다.

c. 반응정지

① G, A, T, C로 라벨한 4개의 튜브를 이용한다.

② 각 튜브에, ddG(dNTP+ddGTP), ddA(dNTP+ddATP), ddT(dNP+ddCTP), ddC(dNTP+ddCTP)의 정지액 2.5□를 각각 넣는다.

③ 37℃에서 적어도 1분간 인큐베이트한다.

④ 표식화 반응이 종료되면, 3.5□를 G로 라벨한 튜브에 가하고 37℃에서 인큐베이션 3∼5분간을 지속한다.

⑤ 정지용액 4□를 각각 가하여 잘 혼합하고, 겔 전기영동을 할 때까지 -20℃에서 인큐베인션 3∼5분간을 지속한다.

(5) 겔 전기 영동

a. 폴리아크릴 아마이드 겔의 작성(8% 폴리아클릴 아마이드 겔)

① 40% 아크릴아마이드 보존액*1 20ml, 요소(생화학용) 42g(7M), 5×TBE*2 20ml, 초순수를 가하여 100ml로 한 후, 멤브레인 필터로 여과하고 脫氣한다.

② TEMED 40□, 과황산암모니움(20mg/ml) 2ml를 가해 겔을 작성한다.

b. 전기영동장치(필자등이 사용한 것)

라피다스 DNA전기영동장치-AE-6150형

콘스타파워-3,000-AE-3131형

겔 건조장치-AE-3700형(ATTO의 제품)

플레이트를 전기영동장치에 셑트하고, 영동조에는 TBE를 넣고 2,000V의 정전압에서 20∼60분간 예비영동을 한다. 웰의 요소를 제거하기 위해 파스츨 피펫을 사용하여 웰을 세정하고 75∼80℃에서 2분간 가열한 샘플을 2∼3□올린다.(샘플은 가열 후 가능한 한 바로 올린다.) 2.oooV의 정전압에서 90분, 180분, 270분의 전기영동을 한다.(영동시간은 필요에 따라서 조정한다.) 영동 종료 후, 겔을 ADVENTEC 514A 여지위에 옮기고, 겔건조기로 건조시킨다.(약1시간)

c. 오토라디오 그라피

Kodak X-ray cassete(3×43cm), Kodak X-ray film X-OMATTM AR(34×43cm), Kodak GBX(현상액, 정착액를 사용하였다.

건조한 겔과 X선 필름을 합하고, 카셋트에넣어, -80℃에서 2∼3일간 방치하고 현상을 한다.

(6) 단백의 N말단 아미노산 배열의 결정

N말단 아미노산 분석은 氣相프로테인-펩티드시켄서(Applied Biosystem Model 470)를 이용하여 행하였다.

*1 : 아크릴아마이드 380g, N-N`-methylene-bis (acrylamide) 20g을 순수에 녹여 1,000ml로 한다. 상기 용액을 탈염수로 세정한 AG501-X8(兩性 이온교환체 : Bio Rad) 10g 정도와 시약스푼 2개의 활성탄을 가해 하룻밤 교반한다. 그리고 여지, 멤브레인필터로 여과하고 갈색병에 넣어 4℃에 보존한다.

*2 : 1L중 54g Tris-base 27.5g 붕산, 0.5M-EDTA 20ml(pH8.0).

13.7 실험 및 결과

(1) pHT 002, pHT 002R의 질레이션 플라스미드의 작성

키티나제의 발현에 필요한 영역을 구하기 위해, 엑소누클레아제에 의해 DNA의 결실(?失)을 하여 결실 플라스미드를 작성하고, E.Coli HB 101을 형질전환하고 콜로이달 키틴 플레이트상에서의 발현의 상태를 관찰하였다.

197∼199페이지에 기재한 방법에 의해, 각각 250전후의 콜로니로부터 200 bp의 간융(間?)으로 결실된 플라스미드를 선택하였다.

pHT-pHTD 01∼pHTD 22

pHT 002R-pHTDR 01∼pHTDR 22

이들 플라스미드를 가진 대장균의 키틴 용해성을 조사하였다. 그 결과의 일부를 그림-13.2a와 13.2b에 나타내었다. 그림-13.3에 나타내었듯이, 1.2kb의 우에서 좌로의 결실 및 0.1kb의 좌에서 우로의 결실에서는 콜로아달 키틴플레이트의 용해존에 변화는 보여지지 않았다. 우로부터 좌로의 1.6kb의 결실(pHTD 07)에서는 용해존의 크기가 감소하였다. 한편, 좌로부터 우로의 1.0kbruftlf(pHT 06)에서는 용해존의 크기에 변화는 생기지 않았지만, 흐려진 용해존을 나타내었다. 그래서, 키티나제의 정상적인 발현에 필요한 영역은 사선으로 나타낸 2.7kb이라는 것이 판명되었다.

(2) 클론화된 키티나제 유전자의 염기배열의 결정

결실도입 실험에서 얻어진 플라스미드를 이용하여, 정상적인 키티나제의 발현에 필요한 영역의 염기배열의 결정을 하였다. 다이데옥시법에 의해, 적어도 1회는 한편의 스트란드로 염기배열의 결정을 하고, 그것을 양방(兩方)의 스트란드로 하였다. 그림-13.4는 이용된 DNA단편의 효소기도, 염기배열 결정법의 방향 및 활성의 발현에 필요한 영역을 나타낸다. 주인(朱印)은 1회의 반응으로 염기배열의 결정을 한 영역을 나타낸다.

그림-13.2 a E.coli HB 101(pHTD)에 의해 콜로이달 키틴 플레이트상에 형성된 용해존[상단](좌로부터) pHTD 02 pHT 002[중단] pHTD 08 pHTD 07 pHTD 06[하단] pHTD 18 pHTD 14 pHTD 11

그림-13.2 b E.coli HB 101(pHTDR)에 의해 콜로이달 키틴 플레이트상에 형성된 용해존 [상단](좌로부터) pHTDR 03 pHTDR 01 pHT 002R [중단] pHTDR 12 pHTDR 09 pHTDR 06 pHTDR 05 [하단]pHTDR 18 pHTDR 16 pHTDR 15

그림-13.4의 점선부분에 2.097bp의 오픈리딩 프레임이 존재한다. 염기배열 및 염기배열로부터 예상되는 아미노산 배열을 그림-13.5에 나타내었다. 이의 2.097bp는 699 아미노산을 코드하고 있다. 염기배열로부터 예상되는 폴리 펩티드의 분자량은 73.676이었다.

그림-13.3 클론화된 키티나제 유전자의 결실화(결失化) 분석

그림-13.4 염기 배열 결정의 방향과 범위

그림-13.5 B.circulans WL-12의 chiA 유전자의 염기배열 및 그것으로부터 추정된 단백질의 아미노산 배열

염기 및 아미노산의 번호는, 개시 코돈의 최초의 염기 및 개시 코돈에 대응하는 아미노산을 출발점으로 한다. 프로모터 배열로 생각되는 -10 및 -35영역에는 밑줄을 그었다. SD배열은 이중밑줄로 나타내었다. E.coli 및 B.circulans WL-12중에 있어서 시그널 배열의 절단점은 ↑표로 나타내었다. S.marcescens의 키티나제A와 相同性을 나타내는 아미노산 잔기는 *표로 나타내었다. Streptomyces plicatus의 두애-□-glucosaminidase와 相同性을 나타내는 아미노산 배열은 O표로 나타내었다. 길다란 반복배열은 四角으로 둘러 그었다.

(3) N말단 아미노산의 결정

대장균에 클론화된 키티나제 및 B.circulans WL-12의 배양액으로부터 정제된 키티나제 A1의 말단 아미노산 배열의 결정을 하였다. 이들 아미노산 배열은 염기배열로부터 추정되는 아미노산 배열의, 대장균에서는 33번째의 루이신으로부터, B.circulans WL-12에서는 41번째의 알라닌으로부터의 배열과 일치하였다.(그림-13.6) 게다가, 시그널 펩티다제에 의한 절단은 대장균에서는 알라닌과 루이신의 사이, B.circulans 에서는 알라닌과 알라닌 사이에서 일어난다고 판명하였다. 또한, 키티나제 A1의 N말단 아미노산 배열이, 염기배열로부터 추정되는 아미노산 배열과 일치하는 것으로부터, 今回 클론화된 키티나제 유전자는, 키티나제 A1을 코드하고 있다는 것이 확인되었다.

그림-13.6 키티나제 A1 前驅□의 시그널 배열

↓ : 프로세싱 위치 ● : 염기아미노산 * : 疎水性 아미노산