제11장

키틴 탈아세틸화 효소

제11장 키틴 탈아세틸화 효소

11.1 서론

키틴탈아세틸화 효소(EC 3.5.1.41)는 키틴을 키토산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소라고 추정된다. 그러나 invitro의 반응에 있어서는 물에 녹지않는 키틴은 좋은 기질이 못된다. 때문에 수용액의 글리콜키틴(하이드록시 에칠화한 키틴 유도체)이 효소반응의 기질로써 사용된다. 이 기질의 경우 치환기의 영향으로 전체 N-아세틸기의 약30%가 유리된 단계이고 반응이 정지되는 문제점을 갖는다.

荒木, 伊?(1974)은 키토산을 생산하는 털곰팡이 Mucor rouxit의 세포질 획분에서 키틴탈아세틸화 효소를 발견하고 약140배까지 정제하였다. 그 후 Kauss, Jeblich Young(1983)은 높은 비활성을 가진 키틴탈아세틸화 효소를 털게 M.miehei, 豆科植物 병원균 Colletrotrium lindemuthianum, 오이, 멜론의 병원균 C.lagenarium 등의 배양액중에 존재한다고 보고 하였다. 이것의 키틴탈아세틸화 효소는 글리콜키틴, 키틴올리고당에 대해서 높은 반응성을 나타내는데, 키틴이나 콜로이달 키틴에 대한 작용은 약하다.

Davis, Bartnicki- Garcia(1984)는 UDP-GlcNAc로부터 새롭게 생성된 키틴분자가 키토산으로 변환되는 것을 M.rouxii의 막효소系로 확인하였다. 또한 그들은 키토산이 글루코사민을 결합한 당 뉴클레오시드로부터 합성될 가능성을 검토할 목적으로 세포질의 뉴클레오시드푸르를 상세히 조사하였으나 그러한 당뉴클레오시드는 검출되지 않아 위의 가능성을 부정하였다.

이러한 실험결과로부터 그들은 키토산은 키틴합성효소(EC 2.4.1.6)와 키틴탈아세틸화 효소의 협동작용에 의해 생성된다고 결론 지었다. 한편, Galvo-Mendez, Ruiz-Herrera(1987)는 세포질에 존재하는 키틴탈아세틸화 효소와 막에 결합한 키틴 탈아세틸화 효소의 2종류의 효소가 M.rouxii에 존재하는 것을 확인하고 각각 다른 역할을 한다고 추정하였다. 즉, 생합성의 과정에 있는 키틴분자는 막결합성의 효소에 의해 한정적으로 칼아세틸화를 받아 유리의 아미노기를 부분적으로 가진 분자로써 세포질에 존재하는 효소로 고도의 탈아세틸화를 받아 키토산 분자로 변환된다.

키틴 탈아세틸화 효소의 기질특이성 세포내의 분포 및 키토산의 생합성연구의 결과 등을 고려하면 생체내에 있어서 키틴탈아세틸화 효소의 역할은 생합성의 과정에 있는 결정화의 정도가 낮은 키틴분자에 작용하여 그것을 키토산 분자로 변환하는 것이라고 추정할 수 있다. 따라서 결정성의 점도가 높은 통상의 키틴 표품으로부터 키토산을 제조하는 목적으로 이용하는 것은 어렵다고 생각된다. 그러나 키틴 탈아세틸화 효소는 키틴-키토산의 생합성이나 그것의 대사 경로를 이해하기 위해 매우 중요하다.

11.2 기질의 조제

글리콜키토산(和光純藥, 40mg)을 포화 NaHCO3 수용액(4.5ml)에 녹이고 빙수로 냉각, 이어서 [3H]-무수초산*1(6.7mCi, 200□□)을 가하고 마그네틱스티러로 가볍게 교반한다.*2 저온실에서 하룻밤 반응하고, [3H]-아세틸기를 아미노기에 도입한다. 더욱, 과잉량의 비표식무수초산(약200□)으로 똑같이 처리하고 모든 아미노기를 N-아세틸화 한다. 그 후 용액을 투석막에 옮기고 탈이온수에 대해서 철저하게 투석한다.

*1 : [14C]-무수초산(벤젠용액)의 경우 진행이 이루어진 뱃치도 있고 예정대로 표식이 도입되지 못하는 것도 있다. [3H]-무수초산의 경우 이러한 실패는 적다.

*2 : 용액의 점성이 크므로 강하게 교반하면 탄산가스의 거품이 꺼지지 않고 끓어 넘치는 것이 있다. 2∼3mg/ml의 글리콜 키토산용액을 사용하면 좋다.

이 조작으로 比방사활성이 1.4×107cpm/mg의 [3H-아세틸]-글리콜키틴이 얻어진다. 또한 非표식 글리콜키틴은 비표식의 무수초산을 이용하여 똑같이 조제한다. 표식 및 비표식 글리콜키틴을 적당한 비율로 혼합하여 효소활성의 측정에 적절한 比방사 활성을 가진 기질로 조제한다. 글리콜키틴은 냉동하면 겔화하고 불용이 되므로 냉장하여 사용한다.*1

상기의 조제에 의해 얻어진 글리콜키틴의 분석결과로부터 글리콜키틴 표품은 3,6-0-디하이드록시에칠글루코사민, 3-0-하이드록시에칠글루코사민, 6-0-하이드록시에칠글루코사민 및 非치환 글루코사민을 몰비 0.22:0.35:0.79:1.00씩 함유하고 있음이 판명 되었다.

11.3 효소활성의 측정법

[원리]

□-1,4-(GlcNAc)n→□-1,4-(GlcNm, GlcNAcn-m)+mCH3CO2H

키틴                  키토산                  초산

키틴 탈아세틸화 효소는 상기의 반응을 촉매한다. 통상, 기질로써 [3H-아세틸]-글리콜 키틴을 이용하여 반응시켜 유리된 [3H]-초산을 초산에칠로 추출하고 그 방사활성을 측정한다.

[표준반응혼액] [3H-아세틸]-글리콜키틴(48□, 114,000cpm : 아세틸기로써 142nmol), 50mM-Tes-NaOH 완충액(pH5.5), 효소표품(1mU이하)

[정량조작] 상기의 표준반응혼액을 글라스 시험관(스피츠형이 추출조작에 적당하다.)중에서 10분간, 30℃에서 인큐베이트 후, 빙수로 냉각하고 동시에 0.2M염산 20□, 1M 초산 5□ 및 물 100□를 가하여 반응을 정지한다.*2 이어서 초산에틸 500□를 가하고 와동(渦動)믹서로 수분간 강하게 교반 후 탁상원심기로 원심(3,000rpm, 5분)하고, 초산에칠층과 물층으로 분리한다. 상층의 초산에칠층을 파스츨피펫으로 소량씩 빨아올려 재빨리 환저시험관에 옮긴다. 물층에 초산에칠을 가하고 같은 조작을 2, 3회 반복하고, [3H]-초산을 완전히 추출한다. 추출한 초산에칠층에 신치레이션 칵테일(PPO/디메칠-POPOP/톨루엔) 8□를 가하여 가볍게 혼합한다. 초산에칠층은 소량의 물을 함유하고 있어서 백탁되지만 원심하면 물은 아래로 침전되어 용액은 투명하게 된다.* 투명한 용액을 바이알에 옮기고 액체신치레이션 카운터로 방사활성을 측정하고 기질의 比방사 활성으로부터 유리된 초산량을 정량한다. 효소 1단위는 1분간에 1□mol의 초산을 유리하는 효소량으로 정의한다.

*1 : 장기보존에는 냉동이 적당하다. 그러나 사용하기 위해서는 음파처리에 의한 가용화가 필요하다.

*2 : 염산은 용액을 산성으로 하고 초산의 해리를 억제하기 위해 초산은 캐리어로 하고 또한 물은 추출할 때 계면을 보기쉽게 하기 위해 가한다.

11.4 M.rouxii 키틴탈아세틸화 효소

[정제법] 키토산 생산주 M.rouxii AHU6019*2는 0.3% 효모엑기스, 1% 폴리펩톤, 2% 글루코스를 함유한 배지(pH4.5)에서 배양한다. 2∼4일간, 30℃에서 진탕배양 후, 여과로 균사체와 배양액으로 분리한다. 균사체는 동결보존한다. 이하의 조작은 모두 0∼4℃에서 행한다. 동결균사체 25g에 대해서 50g의 글라스분말*3을 가하여 유발(乳鉢)로 분쇄한다. 30∼60분 동안 충분히 마쇄 후, 20mM 트리스-염산 완충액(pH7.2) 400ml를 서서히 가하여 현탁액으로 한다. 글라스 여과기를 통하여 글라스 분말과 미분쇄 균사체를 제거한다. 여액은 20분간 20,000×g으로 원심하고 그 상청부분을 조효소로써 사용한다.

*1 : Triton X-100 함유의 신치레이션 칵테일 또는 시판의 Aquasol, Biofluor 등을 이용하면 백탁되지 않는다. 그 자체로 방사활성을 측정할 수 있다.

*2 : 북해도대학 농학부 농예화학과 응용균학 강좌에 의해 분양을 받았다.

*3 : 글라스 섬유를 유발로 마쇄하여 조제한다.

조효소액 200ml(단백 850mg, 효소활성 1127단위)에 분말유안을 가하여 63% 포화로 하고 생성된 침전을 제거한다. 上淸에 다시 분말유안을 가하여 85% 포화시켜 원심분리 한다. 침전을 5mM 초산-초산나트륨 완충액(pH5.3)으로 용해하고 같은 완충액에 대해서 투석한다. 생성된 침전은 원심으로 제거하고 상청을 미리 5mM 초산 완충액으로 평형화한 CM-cellulose 칼럼(2×6cm)에 첨가하고 초산 완충액의 농도구배(5∼100mM)로 전개한다. 효소 활성은 50mM 부근에서 용출된다. 활성획분(단백 19.6mg, 효소활성 842단위)을 푸르하고 농축하여 20mM 트리스-염산완충액으로 용출하면 효소활성은 0.45M-NaCl 용출획분에 회수된다.(단백 0.52mg, 효소활성 93단위).

상기의 정제조작에 의해 키틴 탈아세틸화 효소는 약 140배로 정제된다.(회수율8%). 정제효소는 냉동보존하면 장기간 안정하다. 글리콜키틴과 장시간 반응시켜도 환원력의 증가는 보이지 않고 정제효소 표품은 키틴분해 효소를 함유하지 않는다고 판명되었다.

[정제효소의 제성질] 표준의 반응조건하에서는 초산의 유리가 8nmol에 이를 때까지 반응시간 및 효소량과 초산유리량의 사이에 직선관계가 성립된다. 글리콜 키토산 및 초산에 의한 생성물 저해가 있다. 반응의 최적 pH는 5.5부근이다. 2가 금속이온의 첨가는 반응에 영향을 주지 않는다. 글리콜 키틴에 대한 겉보기의 km치는 0.87g/L로 당잔기로 환산하면 2.6mM에 상당한다.

효소활성의 측정에 이용한 글리콜키틴은 비교적 양호한 기질이다. 그러나 탈아세틸화 반응은 전체 N-아세틸기의 약 30%가 유리한 단계에서 정지한다.

기질의 非치환 글루코사민 함유율이 약40% 이라는 것 또한 이 비치환 글루코사민 잔기에 있는 N-아세틸기 자체에 키틴탈아세틸화 효소가 작용한다고 가정하면 글리콜키틴에 대한 탈아세틸화의 上限은 어느정도 설명할 수 있다. 여기에 관련하여 키틴과 유사한 당구조를 가진 세균세포벽 펩티드글리칸*은 키틴 탈아세틸화 효소로 탈아세틸화 되지 않는 점이 주목된다. 아마도 글루코사민 잔기의 C3번에 위치하는 수산기가 효소와 기질간의 상호작용에서 필순 이라는 것을 의미하고 있다.

글리콜키틴에 대한 상대활성을 100으로 하면 콜로이달 키틴 및 분말 키틴에 대한 상대활성은 35 및 12로 낮다. 키틴올리고당, (GlcNAc)5, (GlcNAc)4, (GlcNAc)3에 대한 상대활성은 각각 116, 44, 12이고 당쇄길이가 짧아짐에 따라서 탈아세틸화를 받지않게 된다. 또한 (GlcNAc)2·GlcNAc, GlcNAc-1-인산, GlcNAc-6-인산, UDP-GlcNAc, GlcNAc-MurAc 및 □-1,4-폴리(N-아세틸갈락토사민)은 탈아세틸화 되지 않는다.

[반응생성물의 동정법] 표식한 기질로부터 유리한 초산은 초산에칠로 추출한 후 소량의 알카리 수용액으로 중화하고 초산법으로 하여 1-프로판올-1.5M 암모니아(7:3)를 전개용매로 하는 페이퍼크로마토그라피로 동정 할 수 있다. 한편, 유리의 아미노기를 가진 당잔기는 반응생성물을 DNP화 후, DNP화 된 폴리머를 산가수분해하고 그 분해물을 페이퍼크로마토그라피로 분리하여 DNP-글루코사민으로써 동정, 또는 정량하는 것이 가능하다.

* : 펩티드 글리칸의 당쇄는 N-아세틸글루코사민산(N-아세틸글루코사민의 C3번에 乳酸기가 에테르 결합한 당)이 번갈아 □-1,4-결합하고 있으며 일종의 키틴 유도체로 본다.

하나의 유리아미노기를 가진 당잔기를 정량하려면 ?, 木下, 星野(1969)가 개발한 방법을 마이크로화 해서 이용한다.

이 방법은 유리의 아미노기를 가진 아미노기 당잔기가 아질산에 의해 탈질소화를 받아 안하이드로□로 변환하는 것 또한 그 생성물이 3-메칠-2-벤조치아졸론하이드라존-염화철과 반응하여 656nm에 흡수극대를 가진 착화합물을 나타내는 것을 이용한다. 1/10정도로 마이크로화 하면, 수nmol 정도의 아미노당을 재현하기 좋고 정량하는 것이 가능하며 콜로이달 키틴이나 키틴올리고당 등의 표식되지 않은 기질에 대한 활성측정도 가능하게 된다. 그러나 트리스등의 good한 완충액類는 이 정량법에 대하여 陽性이라는 점에 유의할 필요가 있다. 또한 이 정량법의 응용으로써 산가수분해 전후의 정량치로부터 다당중에 존재하는 유리의 아미노기를 가진 아미노당 잔기량과 전체 아미노당량을 간편하게 알 수 있고, 키틴-키토산 표품의 탈아세틸화의 정도를 산정하는데에 이용할 수 있다.

키틴 탈아세틸화 효소반응에 있어서 글리콜 키틴의 탈아세틸화 진행과 함께 반응생성물의 리조치움에 대한 차제에 저하하는 것이 관찰되었다. 이러한 감수성의 저하는 보고된 리조치움의 반응기구 및 키토올리고당에 대한 라이소자임의 작용싸이트와도 모순되지 않는다.

[효소의 분포와 생물학적 역할] 키틴 탈아세틸화 효소는 키토산을 생산하는 M.rouxii의 균사체와 배양여액에서 검출된다. 균사체 파쇄액으로부터 조제한 105,000×g막 획분은 미약한 활성밖에 나타내지 않고 대부분의 효소활성은 105,000×g 상청획분에서 회수된다. □-1,4-폴리-(N-아세틸갈락토사민)탈아세틸화 효소를 생산하는 누룩곰팡이 및 펩티드글리칸 탈아세틸화 효소를 생산하는 세균에는 극히 미약한 키틴탈아세틸화 효소의 활성밖에 검출되지 않는다.

위에 서술한 키틴탈아세틸화 효소의 분포 및 기질 특이성 또한 Davis, Bartnicki-Garcia의 키토산 생합성에 관한 연구결과를 맞추어보면 M.rouxii에 있어서 키틴탈아세틸화 효소는 주로 생합성 과정에 있는 키틴분자를 탈아세틸화하여 키토산 분자로 변환하는 역할을 담당하고 있다고 추정된다.

11.5 식물 병원균의 키틴 탈아세틸화 효소

Kauss등은 식물병원균의 C.lindemuthianum과 C.lagenarium에서 M.rouxii의 키틴 탈아세틸화 효소와 유사한 효소를 발견하였다. 이 식물병원균의 효소는 키틴 폴리머보다 키틴올리고당에 대하여 강한 활성을 나타낸다.

[키틴 탈아세틸화 효소의 조제] 효소활성의 측정법은 상기의 방법에 준한다. C.lindemuthianum ATCC 56676의 포자(5×107)를 200ml의 배지(1% 맥아엑기스, 0.4% 효모엑기스, 0.4%글루코스)에 접종하고 배양여액과 균사체로 분리한다. 배양여액에 높은 比활성의 키틴탈아세틸화 효소가 회수된다. 배양여액을 30∼80%의 범위에서 유안염석을 하면 약60%의 효소활성이 침전획분에 회수될 수 있다. 이 침전을 20mM 붕산나트륨-염산완충액(pH8.5)에 녹이고 조효소표퓸으로써 사용한다.

DEAE-Sephacel 및 SP-Sephadex에 의한 정제가 검토되었으나 복잡한 용출패턴을 나타내며 더욱이 회수율도 불충분하다. 그들은 조효소표품을 이용하여 효소의 성질을 검토하였다.

[C.lindemuthianum 키틴 탈아세틸화 효소의 성질] M.rouxii의 키틴탈아세틸화 효소와 같이 글리콜키틴을 기질로 할 경우 전체 N-아세틸기의 약30%가 유리된 단계에서 반응은 정지한다. 이 효소의 최적 Ph는 8.5로 M.rouxii의 키틴탈아세틸화 효소의 저해를 받지 않는다. 더욱이, (GlcNAc)5에 대한 상대활성을 100으로 하면, (GlcNAc)4 98, 글리콜키틴 13, (GlcNAc)3 6, 콜로이달 키틴 2, GlcNAc 0으로 되며 기질특이성에 있어서도 M.rouxii의 효소와 다르다.

이와같이 C.lindemuthianum의 키틴탈아세틸화 효소는 M.rouxii의 것과 효소적인 성질을 달리하고 있다. 전자의 효소는 정제가 불충분하고 또한 크로마토그라피의 용출패턴으로부터 판단하면 여러종의 효소가 존재하고 있어 더욱더 검토할 필요가 있다고 생각된다.

[식물 병원균에 있어서 키틴탈아세틸화 효소의 역할] 식물병원균의 키틴탈아세틸화 효소는 주로 배양액에 분비된 형태로 존재하고 있으며 키틴올리고당을 우선적으로 탈아세틸화 하는 특이성을 가진다. 이러한 성질을 고려하면, 식물병원균의 효소는 키틴탈아세틸화 효소가 아니고 엔도키티나제의 작용으로 키틴으로부터 생성된 키틴올리고당을 탈아세틸화 하는 효소라고 생각하는편이 적당할 것이다. 이 효소의 탈아세틸화 반응에서 키틴올리고당으로부터 생성된 유리의 아미노기를 가졌는지는 분명하지 않다. 그러나 6∼7당 단위의 키토산 올리고당 또는 키틴올리고당은 항곰팡이 활성을 가지며 또한 단백분해 효소의 저해제, 휘트알렉신등의 생산을 식물조직으로 유도하는 에리시타로써 작용하여 식물병원균에 대한 저항성을 유도한다고 보고 되었다. 더욱이 키토산올리고당의 생산은 식물병원균에 취해지면 불리한 조건이라고 생각되어 모순도 크다.

최근 프랑스의 연구그룹은 콩과 식물과 근류균(根瘤菌)에 관한 보고에서 근류균의 배양으로부터 근육(뿌리혹) 형성을 강하게 유도하는 키토테트라오스 유도체를 단리하고 그의 구조를 결정하고 있다. 이 물질은 비환원端의 글루코사민 잔기에 특이한 구조의 N-아실기를 가진다. 생합성 구조에 대해서는 매우 불투명하지만 (GlcNAc)4의 비환원단측에 있는 N-아세틸기가 특이한 구조의 N-아실기로 치환하는 경로를 가정하면 높은 특이성을 가진 탈아세틸화 효소의 관여가 필요하게 된다. 키틴 올리고당에 강한 활성을 가진 식물병원균의 키틴탈아세틸화 효소와 유사한 효소가 근류균에 존재하는지가 흥미 깊은 문제이다.

11.6 후기

키틴의 연간소비량의 약80%가 키토산으로 변환되어 폐수처리의 응집제 바이오리액터의 담체 크로마토용 담체등에 이용되고 있다. 또한 그 화학적 생물학적 특이성을 살린 응용이 검토되었다. 이러한 키토산의 유효이용에는 과격한 화학적 처리를 필요로하지 않은 키토산 제조법으로 안전성이 높은 키토산을 간편하게 적당한 가격으로 얻는 방향도 검토해야 할 과제이다. 미생물을 이용한 키토산의 제조는 그 중 한가지 방향이라고 생각된다. 島原, 岩崎(1982)는 탈아세틸균을 선택하여 배양조건등을 검토하였다. 더욱이 곰팡이에 있어서 키토산 생성은 키틴합성효소와 키틴탈아세틸화 효소의 협동작용으로 이들의 유전자의 클로닝, 유전자 구조의 결정이 행하여져 유전자가 組煥조작에 의해 키토산 생성에 관여하는 효소群을 과잉 생산하는 株가 수립되면 반응을 경로 하여 생성된 물질이라고 생각된다.