제10장

키틴 합성 효소

제10장 키틴 합성 효소

10.1 서론

키틴 합성 효소(EC 2.4.1.6)(Chitin synthetase)는 계통명 UDP-2-acetamido-2-deoxy-D- glucose : chitin 4-□-acetamidodeoxy-D-glucosyltransferase, 또한 別名 chitin-UDP acetylglucosaminyltransferase, trans-N-acetylglucosaminosylase로 불리며 균류, 곤충, 갑각류, 선충에서 추출된다. 이 효소에 의한 반응은 기질의 UDP-GlcNAc(공여체)로부터 수용체(프라이머)에 GlcNAc가 부가되어 GlcNAc사슬이 신장됨으로써 키틴이 합성된다. 그러나 GlcNAc의 수용체(프라이머)에 대해서는 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 그래서 어떤 생물기원의 효소인가 어떤 획분으로부터 조제된 것인다 또한 효소의 정제정도(다른 인자의 공존)에 의해 효소반응에 필요한 인자 또는 반응촉진을 위한 인자에 대해서 다소 달라진다. 예를 들어 Mucor rouxii의 미크로솜 획분의 효소는 GlcNAc에 의해 반응촉진이 보이며 키토덱스트린과 같은 프라이머는 필요하지 않지만 Coprinus cinreus(네나가노히트요다케)의 미크로솜막 획분으로부터 디기토닌 처리한 가용성 효소에서는 GlcNAc 와 GlcNAc2 는 반응을 촉진한다. 또한, Aspergillus flavus 의 무세포 추출액의 효소는 키토덱스트란에 의해 촉진된다. 이와같이, 효소반응 용액에 가하는 인자에 대해서는 각각 고려할 필요가 있다.

[생략기호] BSA:bovine serum albumin,  DTT:dithothreitol,  GlcNAc:N-Acetylglucosaamine,   UDP-GlcNAc : uridine 5'-diphospho-N-acetylglucosamine.

10.2 효소반응 측정

[원리] 일반적으로, 아이소톱(동위원소)으로 라벨한 UDP-GlcNAc를 기질로 이용하여, 효소반응에 의해 합성 된 키틴을, 물에 불용성 이라는 것을 이용한 방법(원심분리 또는 여과)으로 모으고, 또는 크로마토그라피에 의해 분리 한 후, 그의 방사활성을 신치레이션카운터로 측정한다. 세포 또는 조직 중에서 키틴을 합성하는 경우는, 동위 원소로 라벨한 GlcNAc를 키틴에 취입 시킨 후, 키틴을 키티나제로 분해하고, 가용화한 키토올리고당의 방사활성을 신치레이션카운터에 의해 측정한다. 생성된 키틴 확인은, 탁도의 관찰 또는 전자현미경 관찰에 의해 이루어진다.

10.2.1 미생물 키틴합성효소

[측정법] 이것은 무세포추출물(Mucor rouxii, Neurospora crassa, Sacchromyces cerevisiae, phycomyces blakeleeanus 등)을 효소액으로 할 때의 방법이다.

반응액 0.25□중에 0.5mM-UDP-[14C]-GlcNAc(0.2□Ci/□), 20mM-GlcNAc, 0.2mM-ATP, 10mM-MgCl2, 50mM-KH2PO4-NaOH 완충액(pH6.0) 및 효소액(Mucor rouxii 셀프리 추출물)을 함유한다. 22℃에서 30분간 반응시키고, 빙초산 20□ 가하여 반응을 정지한다. 방사활성을 취입한 키틴은 다음 방법으로 측정한다.

[크로마토 법] 여지(whatman No. 3 paper, 4×50□)를 이용하여 여과하고 여기에 95% 에탄올-1M 초산(20:80, 체적비)을 이용하여 하강법으로 크로마토 한다. 원점에 잔존하는 방사활성을 액체 신치레이션 카운터에 의해 측정한다.

[여과법] 전체 반응액을 글라스화이바 필터(Whatman GF/C, 2.4□)를 이용하여 여과하고 여기에 95% 에탄올 -1M 초산(20:80, 체적비) 약30□로 세정한다. 필터 70℃에서 건조한 후 신치레이션 액3□ 들어있는 신치레이션 바이알에 넣고 액체 신치레이션 카운터로 방사활성을 측정한다. 매분[14C]-GlcNAc 1n□을 키틴에 취입시키는 효소량을 1단위로 한다.

[원침법] 반응액에 20배량의 66% 에탄올을 가하여 반응을 정지한 후 1,500×g으로 5분간 원심하고 침전물을 0.1M 초산 암모니움을 함유한 66% 에탄올로 세정 후, 방사활성을 [여과법]과 같은 방법으로 측정한다.

[고찰] 각각의 미생물 효소에 의해 완충액의 조성(pH)이나 첨가물은 다소 다르지만 기본적으로는 상술한 방법과 같다. 또한 효소반응정지에는 정지 후의 실험조작에 알맞은 효소반응 정지법(알카리성 또는 산성 pH, TCA 또는 에탄올 첨가 또는 증비에 의한 단백질 변성)을 고를 필요가 있다.

효소액에 키틴 합성효소의 전구체가 함유되어 있지 않은 경우는 더욱 반응액에 트립신을 최종농도 10∼25□/□, 또는 rennilase(Rovo Bio Labs., Sweden and USA., 和光純藥에서 구입가능)를 4□/□가 되도록 첨가하고 키틴합성효소의 활성화와 효소반응을 동시에 행한다.

[측정법2] 이것은 정제효소(Saccharomyces cerevisiae의 정제효소)를 이용 할 때(여과법)의 방법이다.

1mM-UDP-[14C]GlcNAc(4×105 cpm/□□), 4mM초산마그네슘, 30mM트리스-염산완충액(pH7.5) 또는 이미다졸 완충액(pH7), 0.18□/□포스파티딜세린, 0.3□/□ BSA, 0.3□/□직토닌, 효소액을 함유한 반응액 50□를 1.5□의 엣펜돌프폴리프로필렌 튜브에 넣고, 30℃에서 30분간 반응시킨다. 반응은 최종농도10%트리클로로초산을 첨가해서 정지한다. 「측정법1」과 같이 해서 반응액을 글라스화이바 필터를 이용해서 생성 키틴을 모으고, 액체 신치레이션카운터로 방사활성을 측정한다. 매분, [14C]-GlcNAc 1n□을 키틴에 취입시킨 효소량을 1단위로 한다.

10.2.2 곤충의 키틴 합성효소

무세포 추출물에 있어서는 균류 키틴합성효소 활성측정법과 기본적으로는 같다. 여기에서는, 한층 더 배양세포를 이용해서 키틴합성 측정법을 소개 한다.

[측정법1] 이것은 무세포 추출물(마이크로좀 현탁액)을 이용한 예(여과법)이다. 효소액(Tribolium castaneum의 마이크로좀 현탁액, 약 0.5□ 단백질) 50□와, 최종농도 10mM-MgCl2, 17mM-GlcNAc, 1mM-DTT(dithiothreitol)를 함유한 25mM-트리스-염산완충액(pH7.2) 또는 50mM 인산나트륨 완충액(pH6.5)300□의 혼합액에, 기질인 UDP-[glucosamine-6-3H]-GlcNAc (0.5□Ci, 1.1×106dpm, 46ng, 71p□ 5□를 가하여 22℃에서 효소반응을 개시 하였다.

반응은 최종농도 10%트리클로로초산을 첨가해서 정지하고, 적어도 1시간 빙냉 한 후, 글라스화이바 필터(Whatman GF/C, 2.4□)를  이용하여 생성 키틴을 모은다. 그 필터를 신치레이션 바이알에 넣고, 빙냉한 5%트리클로로 초산 5□로 2회 세정하고, 풍건한다. 여기에, 60℃에서 30분이상 건조 한 후, Soluene-100(Packard Instrument Co., Downers Grove Ⅲ) 0.5□로 4시간 처리를 한 후 톨루엔을 베이스로 한 신치레이션 혼합액을 넣고 액체 신치레이션카운터로 방사활성을 측정한다.

[측정법2] 이것은 배양세포를 이용한 키틴합성이다.

1□의 플라스틱 플라스크 중의 Graces 修正배지(GIBCO社) 30□로 배양세포(MRRL-CH line derived embryo of the tobacco hornworm)를 5일간 배양한다. 그 배양액에 [14C]-GlcNAc(57.2mCi/mM)을 30□(3.0□Ci)첨가하고 3일간 배양한다. 라벨한 세포를 미반응의 GlcNAc를 Puk's Saline A로 세정 후, 동결 용해에 의해 세포를 파괴하고 Puck's Saline A로 4회 세정한다. 그리고, 1M-hyamine hydroxide(methylbenzethonium hydroxide, 양이온 계면활성제, Sigma) 500□로 50℃, 16시간 처리(조직의 용해)한 후, 침전물을 원심(23,000×g)에 의해 모은다.

침전물을 증류수로 3번, 그리고 50mM 인산 완충액(pH6.6)으로 1번 세정 후, 같은 인산완충액(방부제로서 클로로포름을 넣는다)중에서 키티나제(Streptomyces griseus 키티나제, Sigma, 4□/□ at 4 units/□)를 이용해서 50℃에서 48시간 반응한다. 원심에 의해 상등액(키티나제에 의한 분해물)을 모으고, 액체 신치레이션 카운터로 방사활성을 측정한다.

[측정법3] 이것은 키틴섬유의 합성과 肉眼(육안) 및 전자현미경 관찰에 의한 방법이다.

키틴 합성반응은 기본적으로는 「측정법1」에 기초한다. 반응액은 10mM-MgCl2, 17mM-GlcNAc, 1mM-DTT, 2mM-UDP-GlcNAc를 함유한 25□ 트리스-염산 완충액(pH7.2) 1.5□에 마이크로좀 단백질(Tribolium castaneum) 5□을 함유한다. 22℃에서 1시간 반응하고, 형성된 침전물을 저속 원심(1,000×g, 5분)으로 모은다. 이 침전물을 0.1N-NaOH로 처리하고 키틴 이외의 불순물을 가용화 한다. 원심과 수세(증류수로)를 3회 반복한다. 반응에 의한 관찰은 이하의 조작에 의한다.

반응액 또는 알칼리 처리의 현탁액을 200메쉬의 글릿드(카본코드의 銅製 글릿드를 formvar 필름으로 씌운것)에 올려논다. 4분후, 여분의 액을 여지로 빨아들이고, 2%글루타알데하이드를 함유한 10mM 카코딜산 완충액(pH7.4)을 몇방울 떨어뜨려 고정한다. 1분후, 증류수로 세정하고, 2%초산 우라늄으로 30초간 염색한다. 여분의 염색액은 여지로 빨아낸다. 고정을 생략 할 때는, 2%초산 우라늄 또는 2%인텅스텐산으로 60초간 염색한다. 검체는 전자현미경으로 관찰하여 사진을 찍는다.

10.2.3 갑각류의 키티합성 효소

갑각류의 키틴합성 효소의 활성측정도 균류 및 곤충의 경우와 기본적으로는 다르지 않지만, 여기에서는 마이크로좀막에 존재하는 키틴합성 효소의 활성측정법을 소개한다.

[측정법] 이것은 마이크로좀막 키틴합성효소의 활성측정법(원심분리법)이다.

Corex 원심관(10×75□) 중에서, 원심분리에 의해 조제한 마이크로좀막(새우 Artemia salina, 0.1∼2□ 단백질을 함유)을 0.4M-NaCl, 30mM-MgCl2, 5%(v/v)글리세린, 0.65mM-DTT를 함유한 50mM-HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)완충액(pH7.1)에 녹인다. 대조는 마개를 해서 5분간 증비해서 한다. 그리고 0.0625□Ci의 [glucosamine U-14C]-UDP-GlcNAc(최종농도 0.186□M)을 가하고 37℃에서 1∼2시간 반응한다. 반응은 빙냉한 메탄올 1□를 가해서 정지한다. 그리고 -20℃에서 4∼5시간 방치 후, 원심(20,000×g, 30분)한다. 50%메탄올의 可溶部(완충액 및 미반응 UDP_GlcNAc)를 제거하고, 침전물을 클로로포름-메탄올-증류수(10:10:3, v/v/v)용액 5□로 25℃, 5분간 추출한다.

원심 후,(5,500×g, 15분), 먼저 액체를 제거하고 나서 37℃, 질소기류 중에서 클로로포름을 주의깊게 제거한다. 여기에서, 이 건조침전물을 증류수에 현탁하고 방사 활성을 측정해도 좋지만, 대부분의 경우, 한층 더 5mM탄산칼륨(pH10.3)을 함유한 9.5M 요소액 5□로 25℃, 15분간 추출하고, 원심후 침전물을 증류수 15□로 세정 후, 다시 한번 원침하여 1□의 증류수에 현탁한다. 이 현탁액 0.5□를 액체 신치레이션카운터로 방사활성을 측정한다.

10.2.4 선충의 키틴합성 효소

선충의 키틴합성 효소의 활성측정도 균류 및 곤충의 경우와 기본적으로는 같다.

[측정법(원침법)] 50mM-KH2PO4-NaOH 완충액(pH7.0), 17mM-MgCl2, 17mM-GlcNAc, 0.2mM-ATP, 0.2nM-UDP-[U-14C]-GlcNAc(specific activity 9.21GBq/nMol, Amersham International Plc, England)와 효소용액(卵껍질 및 세포질 획분)을 함유한 100□를 37℃에서 1시간 반응시킨다. 반응은 2□의 66% 에탄올을 첨가하여 정지한다. 침전물을 2,000×g으로 5분간 원심분리로 모으고 0.1M 초산 암모니움을 함유한 66% 에탄올로 2회 세정한 후 액체 신치레이션 카운터로 방사활성을 측정 한다. 효소활성은 1□ 단백질(효소)당, 매분, 키틴에 취입된 [14C]-GlcNAc량을 pmol GlcNAc/min/mg으로 표한다.