제9장

키토사나제 활성의 측정법

제9장 키토사나제 활성의 측정법

9.1 원리와 기질의 선택

9.1.1 원리와 활성 측정법

키토사나제 활성측정의 원리는 사용하는 기질에 따라 다르다. 키틴과 달리 키토산은 엷은 산에 녹으므로 pH6.0이하에서는 균일계로 효소반응을 할 수가 있다. 그러나 효소의 최적 pH가 중성부근일 경우 키토산은 불용성의 콜로이달 키토산으로 되므로 불균일계에서 효소반응을 하지 않으면 안된다. 여기에 대해서 키토산의 수용성유도체인 글리콜 키토산은 중성부근에 최적 pH를 가진 효소에 대해서 가용성의 기질로서 이용된다.

키토산 또는 콜로이달 키토산의 어느것이든 기질로 사용할 때에도 생성된 환원당 또는 글루코사민의 정량에 의해 키토사나제 활성이 측정 가능하다. 효소분해에 의한 키토산용액의 점도저하는 이제까지 키토사나제 활성보다도 오히려 키티나제 활성의 측정에 사용되었다. 한편, 콜로이달 키토산을 기질로 한 탁도의 감소에 의한 효소활성의 측정은 키토사나제의 경우 그 예가 매우 적다.

9.1.2 기질의 탈아세틸화도와 활성

최초에는 탈아세틸화도 80% 정도의 키토산이 기질로써 사용되지만 현재는 탈아세틸화도가 다른 각각의 키토산의 시판품을 구입할 수 있다. 그러나, 키토산의 탈아세틸화도와 키토사나제의 기질특이성과의 관계는 아직 충분히 밝혀지지 않았다. 그림-9.1에 나타내었듯이, Penicillium islandicum 키토사나제는 탈아세틸화도 35∼70%의 키토산에 대해서 활성이 높고 종래에 사용되던 탈아세틸화도 80%정도의 키토산은 오히려 분해되지 않는다는 것이 보고되었다. 여기에 대해서 Bacillus circulans MH-K 키토사나제의 경우는 그림-9.2와 같이 탈아세틸화도 80%이상에서는 분해성이 저하하고 50% 이하로 되면 거의 분해되지 않았다. 더욱이 Bacillus sp. No.99-5 키토사나제에 의한 탈아세틸화도 50∼80%의 키토산 분해에서는 탈아세틸화도가 높을수록 빠르게 분해 되었다.

이처럼 효소의 종류에 의해 키토산의 탈아세틸화도에 대한 특이성은 달라진다. 그러나 P. islandicum 키토사나제의 예외는 있지만 키토사나제는 탈아세틸화도가 높은 키토산에 특이적이라고 생각하는 것이 타당할 것이다. 또한, 키티나제가 존재하는 경우 탈아세틸화도 55∼80%의 키토산은 키티나제에 의해서도 잘 분해되므로 키토사나제 활성 측정의 기질로서는 탈아세틸화도가 높은 키토산 적어도 탈아세틸화도 80% 이상의 것을 사용하는 것이 좋다.

그림-9.1 키토사나제 활성과 키토산의 탈아세틸화도와의 관계

키토사나제, Penicillium islandicum의 정제효소(-·-), 키티나제, Serratia marcescens의 배양액(-0-), 활성은 환원당의 정량에 의해 측정하였다.

그림-9.2 키토사나제 활성에 대한 키토산의 탈아세틸화도의 영향

키토사나제, Bacillus cirulans MH-K1의 정제효소, 활성은 글루코사민(-0-_ 및 N-아세틸글루코사민(-▲-)의 정량에 의해 측정 하였다.

9.1.3 키토올리고당

글루코사민의 올리고머인 키토올리고당은, 고속크로를 이용해서 분리할 수 있으므로, 키토사나제 활성, 특히 효소의 작용기작 연구의 기질로서 유용하다. 그러나, 키토올리고당의 검출에는 굴절율을 이용하므로, N-아세틸키토올리고당의 경우처럼 검출감도가 예민하지 않다는 것이 단점이다. 키토사나제에 의한 키토올리고당의 분해데이터는 아직 적지만, 각종 중합도의 키토올리고당의 시판품이 있으므로, 금후의 실험결과가 기대된다. 또한, 엑소-□-글루코사미니다제 활성의 측정에 기질로서 키토트리이톨을 사용한 예에 대해서는 9.3에서 서술한다.

9.2 키토사나제 활성의 측정 例

키토사나제는 최초의 발견이래, 수많은 효소가 각종 미생물로부터 분리 정제 되었지만, 미생물 이외의 효소원으로 부터는 아직 얻어지지 않았다. 미생물 키토사나제는 지금까지 각종 방법으로 활성 측정이 이루어졌다. 그 중, 불용성의 콜로이달 키토산, 가용성의 키토산 및 글리콜키토산을 이용한 활성측정의 예를 이하에 서술한다.

9.1.2 콜로이달 키토산을 이용한 키토사나제 활성의 측정

콜로이달 키토산의 분해에 의한 탁도의 감소 측정 및 생성환원당의 정량에 기초하여 활성측정을 하는 방법이다.

[측정법1] 콜로이달키토산(탈아세틸화도 78%) - 시판의 탈아세틸화도 70%의 키토산을 2□/□의 농도로 0.05M 마레인산에 녹인다. 불용물을 원심분리(1,000×g,10분간)로 제거하고, 용액은 20배량의 동일농도의 마레인산에 25℃에서 24시간 투석한다. 불용물을 원심분리로 제거하면 무색의 점조한 용액이 된다. 이 용액에 KOH를 가하여 pH 7.2로 조정하고, 콜로이달 키토산 현탁액을 얻는다.

콜로이달 키토산 0.5□과 희석한 효소액(streptomyces sp. No.6 키토사나제)을 함유한 반응액 1□를 25℃에서 반응시켜 탁도의 감소를 측정한다. 탁도는 분광광도계(Gilford 2000형)을 이용하여 520□의 흡광도의 감소를 측정한다. 이 조건에서, 매분 흡광도를 1.0 감소시키는 효소량을 1단위로 한다.

[측정법2] 콜로이달 키토산(탈아세틸화도 80%) - 탈아세틸화도 80%인 키토산 15g을 0.2N 염산 1□에 녹인다. 와링브렌더로 교반하면서, 키토산용액에 최초 1N, 후에 0.1N 가성소다를 가하여 pH를 9.0으로 한다. 상등액이 중성이 될 때까지 침전을 원심분리(1,000×g,20분간)에 의해 물로 씻는다. 침전은 증류수에 분산하고, 1.0%(w/v)의 현탁액으로 하고, pH를 6.2로 조정한다.

1.0%의 콜로이달 키토산 1.5□, 0.1M 트리스마레인산 완충액(pH 6.2) 0.5□ 및 효소액(Bacillus circulans MH-k1 키토사나제) 0.5□를 함유한 반응액을 37℃에서 20분간 반응시킨다. 생성된 글루코사민량을 Rondle 및 Morgan 법으로 정량한다(9.2.3 참조). 이 조건에서, 매분 1□□의 글루코사민을 생성하는 효소량을 1단위로 한다.

9.2.2 키토산을 이용한 키토사나제 활성의 측정

키토산을 pH6.0이하의 완충액에 녹이고 효소분리에 의해 생성되는 환원당을 Schales 변법으로 정량 함으로써 활성측정을 한다. 상기「측정법1」의 콜로이달 키토산은 pH6.0에서는 가용성 이므로 환원당의 정량에 의해서도 활성측정이 된다.

[측정법] 키토산 1%(w/v)-키토산(탈아세틸화도99%) 1g을 탈이온수 40□에 분산하고, 1.0M 초산 9□를 가해서 2시간 교반하여 녹이고 10M 초산나트륨으로 pH를 6.0으로 조정하고 0.05M 초산완충액(pH6.0)으로 100□로 한다.

Schales 시약-페리시안화 칼륨 0.5g을 0.5M 탄산나트륨용액 1□에 녹인다.

1% 키토산 용액 1□와 효소액(Bacillus sp. No. 7-M 키토사나제) 1□를 함유한 반응액을 30℃에서 10분간 반응시킨다. 3분간 비등시켜서 반응을 정지한다. 시험관에 반응액 1.5□를 취하고 Schales 시약 2□를 가하여 잘 혼합하고 알루미호일의 뚜껑을 해서 15분간 비등 수욕중에서 가열한다. 냉각 후(불용물 생성시는 여과), 420□의 흡광도를 측정한다. 이 조건에서 매분 1□□의 글루코사민에 상당하는 환원당을 생성하는 효소량을 1단위로 한다.

9.2.3 글리콜 키토산을 이용한 키토사나제 활성의 측정

글리콜 키토산은 pH6.0이상에서도 가용성이므로 최적 pH가 중성부근인 효소의 활성측정에도 사용할 수 있고, Randle 및 Morgan법에 의한 글루코사민의 정량에 의해 키토사나제가 측정된다.

[측정법] 글리콜 키토산(2%, w/v)-글리콜 키토산 2g을 0.1M 염산 20□에 녹이고, 0.2M 초산완충액(pH5.6) 40□를 가한 후 0.1M 가성소다로 pH5.6으로 조정하고 탈이온수로 100□로 한다.

아세틸 아세톤 시약-아세틸 아세톤 1□를 0.5N 탄산나트륨 50□에 녹인 용액으로 조제 후 1시간 이내에 사용한다.

Ehrlich 시약-p-디메칠아미노벤즈알데하이드 0.8g을 무수에탄올 30□에 녹이고 농염산 30□를 가한다. 저온에 저장한다.

2% 글리콜 키토산 용액 1□(상기와 같이 최적 pH의 완충액에 녹인것)와 효소액 1□를 함유한 반응액을 40℃에서 10분간 반응시킨다. 반응은 4분간 비등시켜서 정지한다. 반응액 1□를 눈금달린 시험관에 취하고 탈이온수 1□와 아세틸아세톤 시약 1□를 가해서 잘 혼합하고 20분간 비등수욕중에서 가열한다. 냉각 후 무수에탄올 5□와 Ehrlich 시약 1□를 가하고 한층 더 10□의 눈금까지 메탄올을 가하여 천천히 혼합한다. 시험관을 65∼70℃에서 10분간 유지하여 발색을 완료시킨 후 미분해의 기질을 원심분리로 제거하고 530□의 흡광도를 측정 한다. 기질 및 효소만의 반응액을 대조로 한다. 이 측정조건에서 매분 1□□의 글루코사민에 상당하는 아미노당을 생성하는 효소량을 1단위로 한다.

9.3 엑소-□-글루코사미니다제 활성의 측정

최근 Nocardia orientails IFO 12806으로부터 키토산이나 키토올리고당을 엑소형으로 분해하는 효소가 발견되었다. 본 효소는 키토산을 기질로 해서 활성이 측정 가능 하지만 환원당의 정량에서는 상술의 엔도키토시나제 활성과 구별할 수 없으므로 환원올리고당을 이용한 활성측정법을 이하에 서술한다.

[키토트리이톨의 조제] 키토트리오스 염산염 3g을 물에 녹이고 1N 가성소다로 pH8.0으로 조정한다. 수소화분소나트륨(10□/□) 37□를 가하여 실온에서 교반하면서 2.5시간 반응시킨다. 2N 염산을 가해서 과잉의 수소화분소나트륨을 분해해서 pH를 2∼3으로 조정한다. 이 용액을 물로 평형화한 Dowex 50W(×4, H+형)의 칼럼(2.2×30□)에 흡착시켜 염산의 농도구배 0∼4N로 용출하였다. 닌하이드린 발색에 의해 키토트리이톨의 획분을 모으고 감압농축 후 아세톤으로 침전시켜서 조제하였다.

[측정법] 10mM 키토트리이톨 0.2□ 1.0M 초산완충액(pH5.5) 0.1□와 탈이온수 0.65□를 함유한 반응액에 적당희 희석한 효소액 0.05□를 가하여 40℃에서 10분간 반응시킨다. Schales 시약 3□를 가해서 반응을 정지하고 비등수욕중에서 15분간 가열한다. 냉각 후 420□의 흡광도를 측정하고 생성된 글루코사민을 정량한다. 매분 1□□의 글루코사민에 상당하는 환원당을 생성하는 효소량을 1단위로 하였다.