제 8 장  키티나제 활성의 측정법

키틴·키토산 실험 매뉴얼

(키틴·키토산 연구회 編)

C    C    R    C

제 8 장  키티나제 활성의 측정법

8. 1  원리와 기질의 선택

키티나제 활성 측정의 원리는 사용된 기질에 따라 달라진다. 기질로써 키틴의 사용이 요구되는데, 이 경우는 반응이 불균일계이며 많은 반응시간을 필요로 한다는 점 등, 어려운 점이 많다. 시판되고 있는 키티나제 제품 가운데에는 기질로 키틴을 사용해서 48시간 반응 후의 N-아세틸글루코사민의 생성량을 측정하여, 활성의 단위를 표로 만든 예(Sigma, Koch Light의 키티나제 제품)도 있지만, 키틴을 기질로한 활성 측정법은 키티나제의 정제나 생화학적 연구에는 이용할 수 없다. 현재, 키티나제의 활성측정에 널리 사용되고 있는 기질은 콜로이달 키틴과 같은 재생 키틴 및 키틴의 수용성 유도체인 글리콜키틴이다. 또한, N-아세틸글루코사민의 올리고머나 그 유도체와 같은 저분자 화합물도 키티나제의 작용기작 등의 연구에 기질로써 이용되고 있다.

8. 1. 1  재생 키틴

콜로이달 키틴은 키틴을 농산(황산이나 염산 등)에 용해한 후, 대량의 물 또는 물과 알코올의 혼합액에 주입해서 재 침전시켜 조제한다. 농 황산을 이용한 조제법의 예를 다음에 나타내었다.

[콜로이달 키틴의 조제] 분말 키틴 20g을 500□의 탈이온수에 분산시킨 비이커를 얼음과 寒劑로 잘 냉각하고, 미리 냉각한 농 황산 640□를 가한다. 첨가 시에 온도가 10℃이상으로 상승되지 않도록 주의하고, 농 황산은 50□씩 약 12시간 걸쳐서 가한다(키틴이 녹기 시작할 때, 급속히 온도가 상승하므로 주의한다). 키틴의 점조한 용액은 글래스울로 여과 후, 약 10배량의 탈이온수(또는 50% 에탄올)에 교반하면서 주입한다. 침전된 재생 키틴 즉, 콜로이달 키틴은 대량의 수도수로 pH 5.0이하가 될 때까지 반복하여 경사(傾斜) 세정한다. 또한, 콜로이달 키틴은 셀로판 튜브를 이용하여 처음에는 수돗물, 나중에 탈이온수로 3일간 투석한다. 그 후, 적당한 용량의 시약 병에 分注하고 오토클레이브로 살균한 후, 냉장고에 저장한다. 또한, 콜로이달 키틴의 농도는 그 건조중량으로부터 계산하여 구한다.

콜로이달 키틴은 조제법에 의해 동일한 분산 상태의 것을 얻기 힘든 단점이 있지만 동일한 키틴으로부터 상기의 방법으로 조제할 경우 콜로이달 키틴의 효소 분해성의 차이는 대단히 작다. 상기의 콜로이달 키틴과 그 외의 방법으로 조제한 것과의 비교에 대해서는 데이터가 없으므로 언급하지 않는다. 최근, 메탄설폰산을 이용하여 조제한 콜로이달 키틴은 황산이나 염산을 이용하여 조제한 콜로이달 키틴 보다도 효소 분해되기 쉽다는 것이 보고되었다.

콜로이달 키틴을 기질로 할 경우, 키티나제 활성의 측정은 탁도 저하의 측정(8. 2. 1 참조) 또는 환원당의 정량(8. 2. 4 참조)에 의해 행하여졌다. 比濁法은 키틴 분해의 초기 반응 즉, 엔도 키티나제 작용을 측정할 수 있다는 점에서 우수하다. 또한, 분해 액으로 □-글리코시다제 제품(달팽이 소화관 추출액 등의 시판 품)을 가해서 반응시켜 생성된 N-아세틸글루코사민의 정량에 의해서도 활성 측정을 할 수 있지만, 이 방법은 조작이 번잡한 것이 단점이다.

콜로이달 키틴 외에 키토산을 N-아세틸화 함으로써 조제한 N-아세틸화 키토산(8. 4 참조)도 키티나제에 의해 분해되기 쉽다. 게다가, 키토산을[3H]-무수초산으로 아세틸화 하여 N-아세틸화 키토산 즉, 재생 [3H]-키틴을 조제하고 분해 생성물의 방사능 측정으로 키티나제 활성의 측정이 행하여졌다(8. 2. 3 참조).

또한, 키틴으로부터 조제된 부분 탈아세틸화 키토산의 N-아세틸글루코사미니드 결합은 키티나제에 의해 선택적으로 분해되므로(제 7장), 부분 N-아세틸화 키토산도 키티나제의 작용기작 연구의 기질로써 이용할 수 있다.

8. 1. 2  수용성 키틴 유도체

수용성 키틴 유도체로써 카르복시메칠 키틴과 글리콜 키틴이 잘 알려져 있으나, 후자가 기질로서 널리 사용되고 있다. 최초 사용된 에칠렌옥사이드 대신에 에칠렌클로로하이드린(2-클로로에탄올)을 이용해서 키틴을 글리콜화한 글리콜 키틴의 조제법에 대해서 다음에 나타내었다.

[글리콜 키틴의 조제]  분말 키틴 5g을 42%(w/w) 가성소다 100□ 중에 분산시키고, 감압 데시게이터(∼20□Hg) 중에 실온에서 4시간 방치 후 가성소다를 키틴에 침투시킨다. 알칼리 키틴을 여과하고 소량의 42%(w/w) 가성소다로 세정 후, 여과포에 싸고 목적 키틴의 3배량 까지 압착한다(약 15g). 이 알칼리 키틴의 케이크를 폴리비닐製 비이커에 옮겨서 잘 분쇄하고, 여기에 잘게 분쇄한 얼음(알칼리 키틴의 약 3.5배량, 50∼70g)을 가하고 잘 교반하여 반죽하며 으깬다. 20∼30분 째에 고점성의 조청상태의 알칼리 키틴 용액이 얻어진다. 이 용액에 가성소다를 가하여 250□로 희석시킴과 동시에 가성소다의 최종 농도가 14%(w/w)가 되도록 조정한다. 이 단계에서 겔화되는 경우는 글리콜화가 지장을 받게 되므로, 0℃ 이하로 냉각하고 잘 교반하여 균일한 용액으로 한다. 알칼리 키틴의 용액은 얼음으로 냉각하고, 에칠렌클로로하이드린(키틴 1g 당 6∼8□)을 적하 하면서 가하여 30분간 교반한다. 실온에 하룻밤 방치 후 다시 얼음으로 냉각하고, 무수초산(10□)을 첨가해서 30분간 교반하여 아세틸화한다. 초산으로 중화 후 3일간 수도수에, 그 후 대량의 탈이온수에 투석한다. 투석액은 원심분리하여 상등액을 동결건조한다. 글리콜 키틴의 收量은 ∼4g 이다.

글리콜 키틴의 조제에 대해서도 키틴 원료의 차이에 따라 얻어진 글리콜 키틴의 효소 분해성에 難易의 차이가 있으므로, 키티나제 활성의 비교는 동일한 기질을 이용해서 해야한다. 그러나, 글리콜 키틴 용액의 점도는 pH나 이온강도에 의해 변화되지 않으므로 글리콜 키틴은 이 점에서 카르복시메칠 키틴 보다도 기질로서 우수하며, 점도의 측정(8. 2. 2 참조)이나 환원당의 정량(8. 3. 1 참조)에 의해 용이하게 키티나제 활성을 측정할 수 있다. 점도법에 의한 활성 측정은 前述한 비탁법과 같은 엔도 키티나제 작용이 측정된다. 또한, 6-O-옥시프로필 키틴도 점도법에의한 활성 측정의 기질로서 이용할 수 있다.

8. 1. 3  N-아세틸 키토올리고당 및 그 유도체

N-아세틸 키토올리고당은 수용성이며, 키티나제에 의해 잘 분해되므로 기질로써 이용할 수 있다. 특히, N-아세틸키토올리고당과 그것의 환원말단 잔기를 환원한 환원 N-아세틸키토올리고당은 동시에 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분리할 수 있으므로, 이것들은 효소의 작용기작의 연구에 적용된다. N-아세틸키토올리고당은 키티나제의 동력학적 연구의 기질로써도 이용되고있다(8. 3. 3 참조). 또한, N-아세틸키토올리고당의 p-니트로페닐 유도체가 합성되었는데, 그 중 p-니트로페닐-N-아세틸키토헵타오스는 비색법에의한 라이소자임 활성 측정의 기질로써 사용할 수 있다고 보고되었다.

또한, p-니트로페닐-N-아세틸키토비오스는 미생물 키티나제에의해 분해되어, p-니트로페놀을 유리하므로 활성 측정에의 이용도 고려된다. 이들의 p-니트로페닐-N-아세틸키토올리고당과 그 효소 분해물은 고속액체크로마토그래피로 용이하게 분리할 수 있으므로 키티나제의 작용기작의 연구에는 매우 유용한 물질이다.

8. 2  미생물 키티나제

미생물 키티나제의 연구에서는 여러 가지 방법으로 활성 측정을 하고 있다. 그 중, 콜로이달 키틴을 기질로 이용한 비탁법 및 생성 환원당의 정량에의한 방법, 글리콜 키틴을 기질로 이용한 점도법, [3H]-키틴을 기질로 한 방사능 측정에 의한 방법에 대해서 이하에 서술한다. 그 외의 활성 측정법에 대해서는 8. 3 및 8. 4를 참조하기 바란다.

8. 2. 1  비탁법에의한 키티나제 활성의 측정

[원리]  콜로이달 키틴의 분해에 따라 반응액의 탁도가 감소되는 것에 기초한 방법으로써, 적당한 분광광도계를 이용해서 탁도를 측정한다. 최초에 보고된 측정법과 그 변법에 대해서 서술한다.

[재료]  콜로이달 키틴 - 조제법은 8. 1. 1을 참조할 것. 조제한 콜로이달 키틴은 그 침강속도에 의해 기질, 효소 정제용의 흡착제, 배지용으로 나누어서 사용되고 있지만, 그대로 사용해도 지장 없다.

[측정법 1]  시험관(파이렉스製)에 콜로이달

키틴 현탁액(1.8□/□) 1□, 0.6M-크엔산

-1.2M-Na2HPO4 완충액(pH 5.3) 1□ 및 효소액

(Streptomyces antibioticus 키티나제)

0.1∼4□를 함유한 반응액 6□를 넣고, 37.5℃

에서 반응시킨다. 시험관은 고무마개를 해서 반응

중 15분 정도에서 거꾸로 해서 잘 혼합한다.        그림-8. 1  키티나제에의한 콜로이달키틴

반응 최초의 탁도(T0)와 2시간 반응 후의 탁도        현탁액 탁도의 감소와 효소량과의 관계

(T2)를 Pulfrich 비색계로 측정한다. 그림-8. 1에     키티나제, Streptomyces antibioticus의

나타내었듯이, 탁도의 감소가 7.5%를 넘지 않는     배양액. 2시간(B) 반응후의 탁도의 감소를

범위에서는, 효소량은 logT0/T2에 비례한다.         1시간(A) 및 4시간(C) 반응 후의 결과와

더욱이, 이 조건에서 탁도를 50% 감소시키는        함께 나타내었다. 탁도의 감소가 50%정도

효소량을 10 단위로 하면 효소량(E)은 다음과        까지는 효소량과 잘 비례하고 있다.

같이 된다.

E = 10/0.3 log T0/T2

콜로이달 키틴 농도 0.4□/□ 이하에서 키틴의 농도와 탁도는 비례하고, 탁도는 pH(3∼9의 범위) 및 염 농도의 영향을 받지 않는다. 그러나, 이 방법은 측정 시의 콜로이달 키틴의 분해율이 커서, 분해가 진행됨에 따라서 콜로이달 키틴 현탁액이 침전되기 쉬워서 불안정하다.

[측정법 2]  측정법 1의 개량법이다. 반응액은 1.3% 콜로이달 키틴 현탁액 0.32□, 0.2M 초산 완충액(pH 5.2) 1.68□ 및 효소액(Aeromonas hydrophila 키티나제) 2.0□를 함유한다. 반응액 최초의 흡광도(A610)는 약 0.9이다. 효소반응은 37℃에서 60분간 하고 Hitachi 분광광도계 139型을 이용해서 610□의 흡광도를 측정한다. 효소액 자체 및 효소액 대신 물을 이용한 반응액을 대조로 한다. A610의 감소가 20%를 넘지 않는 범위에서는 효소량은 흡광도의 감소와 비례하였다. 이 조건에서, 흡광도(A610)를 每分 1% 감소시키는 효소량을 1단위로 한다.

8. 2. 2  점도법에 의한 키티나제 활성의 측정

[원리]  글리콜 키틴의 분해에 따라 반응액의 점도가 저하되는 것에 기초한 방법으로써, 오스트왈드 점도계 등 간단한 장치를 이용해서 측정할 수 있다.

[재료]  글리콜 키틴 - 조제법은 8. 1. 2를 참조할 것.

오스트왈드 점도계 - 증류수의 유속이 30∼40초 정도(30℃)의 것을 선택.

[측정법]  0.2% 글리콜 키틴 5□와 0.2M-Na2HPO4-0.1M 크엔산 완충액(pH 3.6) 4□를 오스트왈드 점도계에 넣고 잘 혼합하여 점도계를 항온조 중에 고정해서 30℃에서 10분간 보온한다. 적당히 희석하고, 미리 30℃에서 10분간 보온한 효소액(Aspergillus niger 키티나제) 1□를 가해서 반응을 개시하고, 적당한 간격으로 반응액의 점도(유속)를 측정한다. 효소액 대신에 물을 이용한 반응액을 대조로 한다. 그림-8. 2에 나타내었듯이, 글리콜 키틴 용액의 比점도는 경시적으로 감소한다. 비점도가 반감하는데에 걸리는 시간(분)은 효소량에 반비례하므로, 이 조건에서 30분간에 비점도가 반감되는데 필요한 효소량을 1단위로 한다. 그림-3. 8에 나타내었듯이, 효소량은 키티나제 활성과 잘 비례한다.

그림-8. 2  키티나제에의한 글리콜 키틴     그림-8. 3  키티나제 활성과 효소량과의 관계

용액의 점도저하의 경시변화               그림-8. 2의 점도저하 곡선에 의해

키티나제, Aspergillus niger의 정제 효소.               키티나제 활성을 구하였다.

[효소액의 희석율] A:1/400  F는

최초의 비점도의 반감치를 나타낸다.

이 방법은 예민하지만, 조작이 번거롭고 시간이 걸리는 단점이 있으며, 많은 시료의 활성 측정을 하는데는 불편하다. 또한, 6-O-하이드록시프로필 키틴을 이용한 활성 측정도 우베로데 점도계를 이용해서 똑같이 측정한다.

8. 2. 3  [3H]-키틴을 이용한 키티나제 활성의 측정

[원리]  [3H]-키틴의 분해에 의해 생성되는 [3H]-N-디아세틸키토비오스는 물이나 트리클로로초산에 녹으므로, 그 방사능 측정에 기초한 방법이다.

[재료]  [3H]-키틴 - 키토산을 [3H]-무수초산으로, N-아세틸화 하여 조제한다.

방사능의 측정 - 적당한 방사능 측정장치가 필요하다.

[측정법 1]  반응액은 0.05M 인산칼륨 완충액(pH 6.3) 100□ 중에 [3H]-키틴 3.6□/□(1.22×106 cpm/□)과 효소액(Streptomyces griseus 키티나제)을 함유한다. 진탕하면서 30℃에서 반응시키고, 10% 트리클로로초산 0.3□를 가해서 반응을 정지시킨다. 반응액은 원심분리(200×g, 5분간)한 후, 상등액 200□를 주의 깊게 취하고, 신칠레이션관에 옮긴다. 10□의 Aquasol(New England Nuclear)을 가한 후, 시료의 방사능을 측정한다.

그림-8. 4에 나타내었듯이, 각 효소 농도에 있어서 N-디아세틸키토비오스로 表한 생성량은 반응시간에 대해서 직선적으로 증가하지 않는다. 그러나, Algranati의 방법에 의해 반응의 초기 속도를 구하면 그림-8. 5처럼 되며, N-디아세틸키토비오스 생성량은 효소량에 비례한다. 또한, 이 키티나제는 [3H]-키틴(N-아세틸화 키토산)을 콜로이달 키틴 보다도 잘 분해하였다.

그림-8. 4  키티나제에의한 [3H]-키틴           그림-8. 5  키티나제 활성과 효소량과의 관계

분해의 경시변화                      그림-8. 4의 분해곡선으로부터 Algranati의

키티나제 Streptomyces griseus의 정제효소       방법에 의해 반응의 초기 속도를 구하였다.

[효소량] ―●― : 5□     ―○― :  10□

―▲― : 15□     ―△― : 20□

[측정법 2]  上記의 개량법으로써, 측정감도를 상승시켰다. 반응액 0.1□중에 [3H]-키틴 1.5□/□(1.9×106 cpm/□), 0.15M 크엔산나트륨 완충액(pH 3.0)과 효소액(Saccharomyces  cerevisiae 키티나제)을 함유한다. 37℃에서 30분 또는 1시간 반응 후, 10% 트리클로로초산 0.2□를 가해서 반응을 정지한다. 반응액은 글라스화이바필터를 이용하여 감압으로 직접 신칠레이션관으로 여과하고, 0.2□의 물로 3회 세정한다. 12□의 Hydroflour(National Diagnostics)를 가하고, 시료의 방사능을 측정한다. 이 조건에서, N-아세틸글루코사민으로 表한 생성량 60n□까지 효소량과 비례하므로, 每分 1□□의 아세틸글루코사민을 생성하는 효소량을 1단위로 한다.

8. 3  동물(곤충·갑각류) 키티나제

8. 3. 1  글리콜 키틴을 기질로 이용한 환원력 측정법

[원리]  효소반응에 의해 키틴 사슬이 가수분해되어, 당의 환원 말단이 증가한다. 그 환원력을 측정함으로써 효소활성을 정량한다.

[시약]  기질용액 - 최적 pH의 완충액 즉, 50mM 인산 완충액(pH 8.0)으로 녹인 0.05%(w/v)글리콜 키틴 용액.

糖 呈色 용액 - 0.5M 초산나트륨 수용액으로 녹인 1.37mM 페리시안화칼륨(K3[Fe(CN)6]) 용액.

[측정법]  약 10□ 시험관에 기질용액 1□를 넣고 32℃로 가온한다. 여기에 효소액(10∼50□)을 가해서 효소반응을 개시한다. 일정시간 반응 후(15분∼2시간) 糖 呈色液 2□를 가해서 반응을 정지하고, 더욱 뚜껑을 막고 비등 수욕 중에서 가열하여 환원 반응을 완결시킨다. 냉수로 냉각 후, 420□의 흡광도를 측정한다. 대조는 효소반응이 일어나지 않도록 기질 용액에 당 정색용액을 넣은 후, 효소 용액을 가한다. 똑같이 15분간 증비 후, 420□의 흡광도를 측정한다. 대조의 흡광도로부터 샘플(효소반응한 것)의 흡광도를 나타낸 수치를 계산하여, 그것의 수치를 □A420으로 한다.

[결과 및 고찰]  타바코스즈메가(담배 말벌)로부터 부분 정제한 엔도형 키틴 분해효소(키티나제)를 이용하여, 효소 농도 의존성을 조사한 결과를 그림-8. 6에 나타내었다. 효소액은 50□를 이용하여 32℃에서 2시간 반응하였다. 또한, N-아세틸키토올리고당(GlcNAc, n=1∼6)의 농도와 □A420(이 때의 대조는 올리고당이 들어있지 않은 것을 이용한다) 농도와의 관계를 그림-8. 7에 나타내었다.

효소농도(상대비)                       N-아세틸키토올리고당의 농도(□M)

그림-8. 6  키티나제에의한 글리콜키틴의        그림-8. 7  N-아세틸키토올리고당의 농도와

가수분해에 따른 환원력의 증가와                환원력과의 관계

효소 농도와의 관계                  각종 농도의 N-아세틸 키토올리고당(GlcNAcn, n

타바코스즈메가의 외피를 호모게나이즈하고           =1∼6)용액 1□에 당 정색액 2□를 넣고 15분간

硫安分劃으로 부분 정제한 효소액(키티나제)을        증비 후, 420□의 흡광도를 측정하였다. 농도

적당히 희석하고, 그 50□를 글리콜 키틴 용액        제로의 흡광도와의 차를 □A420 으로써 표시

1□에 가하고, 32℃에서 2시간 반응하였다.            하였다. Ⅰ∼Ⅵ, GlcNAcn(n=1∼6). N-아세틸

□A420이 0.3까지는 직선적으로 반응이 되는           키토올리고당이 클수록 □A420이 큰 수치를

것을 알 수 있다.                                    나타내는 것을 알 수 있다.

이 그림으로부터 각종 N-아세틸키토올리고당의 □A420(환원력)이 달라진다는 것 특히, 키틴 사슬이 긴 경우가 큰 수치를 나타내는 것을 알 수 있다. 그러므로, 효소반응의 특이성에 의해서는, 키틴 사슬이 긴 N-아세틸키토올리고당을 생성하는 효소의 경우가 활성이 강하게 보여지는 경우가 있다. 그림-8. 6으로부터는 효소반응은 □A420이 0.3까지는 효소 농도에 비례하는 것을 알 수 있다. 이 수치(0.3)는 그림-8. 7로부터 알 수 있듯이, 40∼120□M의 N-아세틸키토올리고당에 상당하며, 또한, 반응율은 5∼10%(GlcNAc6∼GlcNAc로 환산해서)로 계산된다.

8. 3. 2  pNP-□-GlcNAc를  기질로 이용한 흡광도 측정법

[원리]  엑소형의 반응에 의해 기질로부터 유리한 p-니트로페놀을 분광학적으로 정량한다.

[시약]  기질용액 - 최적 pH의 완충액 예를 들어, 50mM 인산완충액(pH 6.0)으로 녹인

0.1mM-pNP-□-GlcNAc(p-nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-□-D-glucopyranoside) 용액.

[측정법] 光路長 1□의 석영셀에 2□의 기질 용액을 넣고, 25℃로 가온한다. 25℃의 측정실에서 행할 때는 기질 용액을 미리 그 온도로 하면 온도 조절하는 셀 홀더는 불필요하다. 대조 측에서도 같은 기질 용액을 넣는다. 반응(샘플) 측에 효소액(5∼50□)을 가하고, 곧바로 교반하여 337□의 흡광도(□A337)의 경시 변화를 측정한다.

[결과 및 고찰]  누에에서 부분 정제한 엑소형 키틴 분해효소(□-N-아세틸글루코사미니다제)를 이용한 반응의 □A337□의 경시 변화를 그림-8. 8에 나타내었다. 初速度의 계산은 제로 시간(효소를 혼합할 시간이 필요하므로, 약 10초간은 측정할 수 없으므로 엄밀하게는 제로 시간은 아니다)으로부터 접선을 그러, 그 기울기로부터 계산한다. 1M 농도의 기질이 완전히 분해될 때의 □A337(□A□337)이 -3,500 증가하는 것으로부터, 이 수치를 이용해서 반응한 농도를 계산한다. 예를 들면, 그림-8. 8에서는 □A337이 2분간에 0.08 증가하므로 初速度 □0는,

□0 = 0.08/3,500/2 = 11.4×10-6 M/min

= 11.4□M/min = 0.19□M/sec

또는, 반응액의 체적이 기질 용액 2□와 효소 용액의 5□를 합해서 2.005□(2.005×10-3□)에 의해,

□0 = 0.19×10-6×2.005×10-3 mol/sec

= 0.38nmol/sec

으로 계산된다.

그림-8. 8  엑소형 키틴 분해효소에의한 pNP-□-GlcNAc의 가수분해

반응의 경시 변화

타바코스즈메가의 외피를 호모게나이즈한 유안 분획과 하이드록시아파타이트·크로마토그래피로 부분 정제한 효소액(□-N-아세틸글루코사미니다제) 5□를, pNP-□-GlcNAc 용액(50mM 인산 완충액, pH 6.0) 2□에 가하여 25℃에서 반응하였다. 대조측에 pNP-□-GlcNAc 용액을 각기 333□의 흡광도 변화를 추적하였다. 전체 반응의 25%까지는 직선적으로 반응이 되는 것을 알 수 있다. 이 기울기로부터 초속도를 계산한다.

그림-8. 9  엑소형 키틴분해 효소에 의한 pNP-□-GlcNAc의 가수분해

반응의 초속도와 효소 농도와의 관계

타바코스즈메가의 외피를 호모게나이즈한 유안 분획과 하이드록시아파타이트·크로마토그래피로 부분 정제한 효소액(□-N-아세틸글루코사미니다제)를 적당히 희석하고, 그  10□를, pNP-□-GlcNAc 용액(50mM 인산 완충액, pH 6.0) 2□에 가하여 25℃에서 반응하였다. 그림-8. 8에 나타낸 방법으로 초속도를 구한다. 초속도가 효소 농도에 비례한다는 것을 알 수 있다.

그림-8. 8에서, 전체 반응의 적어도 25% 까지는 직선적으로 된다는 것을 알 수 있다. 이 계산법으로 구한 초속도의 효소 농도 의존성을 그림-8. 9에 나타내었다. 초속도가 효소 농도에 비례한다는 것을 알 수 있다.

8. 3. 3  N-아세틸키토올리고당을 기질로 이용한 HPLC에 의한 정량법

[원리]  엔도형 및 엑소형의 효소 반응에 의해 생성 및 미반응된 N-아세틸키토올리고당을 HPLC로 분리 정량한다.

[시약]  기질 용액 - 최적 pH의 완충액 예를 들어, 50mM 인산 완충액(pH 6.0)으로 녹인 0.1mM N-아세틸키토올리고당(GlcNAcn, n=2∼6) 용액.

[측정법]  원심 침전관(10□, 나사부착, 원추, Pyrex)에 100□의 기질 용액을 넣고, 25℃로 가온한다. 여기에 효소액(5∼50□)을 가하고, 교반하여 나사부착 마개를 한다. 25℃에서 일정시간 반응 후, 비등욕 중에 걸쳐(3∼30분) 효소 반응을 정지한다. 냉각 후, 일정량(10□)을 HPLC에 건다. 칼럼은 먼저 Tosoh TSK PWL(0.75×7.5□)의 카드 칼럼을 첨가한 Tosoh TSK G 2000 PW column(0.75×60□), 용출액은 脫氣한 증류수, 칼럼온도는 실온(약 25℃), 유속은 0.5□/min, 검출은 210□에서의 흡광도(A210 □), 레인지(풀 스케일)는 0.04, N-아세틸키토올리고당 GlcNAcn(n=1∼6)의 농도와 피크의 높이와의 관계는 각각 34.2, 45.3, 61.1, 82.5, 93.2, 122□/mM 이다(이것은 authentic  표품을 사용하여 미리 조사해야 한다.).

초속도의 계산을 아래에 나타내었다. 먼저 각각의 피크로부터 그에 상당하는 N-아세틸키토올리고당의 농도를 계산한다. 그러나, 이 계산농도는 반응액 농도가 반응정지를 위한 증비에 의해 농축되므로 정확하지 않다. 그래서, 미 반응 기질과 반응물의 和가 반응에 이용된 기질 농도가 되도록 보정치(f)를 구하고, 그 보정치를 이용하여 반응량을 산출한다. 보정치의 계산에는 2가지 방법이 있다.

[계산법 1]  N-아세틸키토올리고당 농도를 N-아세틸글루코사민 잔기 농도로 생각한다.

여기에서, [GlcNAci]t 는 t시각의 GlcNAci의 농도, [GlcNAcn]0는 기질에 이용한 GlcNAcn의 제로시간의 농도를 표시한다. 또한, □는 N-아세틸키토올리고당 GlcNAci의  농도에 I를 상정한 것의 전체의 和를 표시한다.

[계산법 2]  기질이 2가지의 생성물로 가수분해될 경우, 생성물의 1가지만을 고려하는 간편법, 이 경우, N-아세틸키토올리고당의 농도로 생각한다.

다음에 초속도를 계산한다.

□i = (1/f)[GlcNAci]t/t

□n = ([GlcNAcn]0-(1/f)[GlcNAcn]t)/t

여기에서, [GlcNAci]t는 t시각의 GlcNAci의 농도, [GlcNAcn]0 과 [GlcNAcn]t 는 기질에 이요한 GlcNAcn의 初농도와 t시각의 농도를 각각 나타낸다. 1/i는 GlcNAci(i=1∼n)에 관한 초속도.

[결과 및 고찰]  차 새우의 간장으로부터 부분 정제한 엔도형 효소(키티나제)를 이용하였고, GlcNAc5의 GlcNAc3와 GlcNAc2로의 가수분해와 GlcNAc4의 2개의 GlcNAc2로의 가수분해 반응의 HPLC 분석의 결과를 그림-8. 10과 그림-8. 11에 나타내었다.

[계산예]  그림-8.10의 GlcNAc5 → GlcNAc3 + GlcNAc2의 가수분해의 계산 예를 다음에 나타내었다.  GlcNAc5의 초농도는 0.1mM.

10분 후의 각 키토올리고당의 농도는 다음과 같이 된다.

[GlcNAc5] = 12.6/93.2 = 0.135mM

[GlcNAc3] = 1.71/61.1 = 0.0280mM

[GlcNAc2] = 0.99/45.3 = 0.0218mM

계산법 1에서는, 전체의 N-아세틸키토올리고당을 이요하여 계산한다.

f = (5×0.135+3×0.0280+2×0.0218)/5×0.1) = 1.605

계산법 2에서는, GlcNAc5와 GlcNAc2를 이용하여 계산한다.

f = (0.135+0.0218)/0.1 = 1.57

계산법 1과 2에서는, 계산법 1의 경우가 f의 치가 약간 크다. 이것은 GlcNAc3의 피크에 GlcNAc5의 피크의 테일링이 무겁기 때문이다. 또한, 계산법 2의 f를 이용하여 GlcNAc5의 분해의 초속도를 구하는 것으로 한다.

□5 = {0.1-(1/1.57)×0.135}/10 = 0.00139mM/min = 1.39□M/min

그림-8. 10  GlcNAc5→GlcNAc3+GlcNAc2의    그림-8. 11  GlcNAc4→2GlcNAc2 반응의 HPLC

반응의 HPLC 패턴                           패턴

칼럼은 먼저 Tosoh TSK PWL(0.75×7.5□)의        칼럼은 먼저 Tosoh TSK PWL(0.75×7.5□)의

카드칼럼을 가진 Tosoh TSK G 2000PW column     카드칼럼을 가진 Tosoh TSK G 2000PW column

(0.75×60□), 용출액은 증류수, 칼럼온도는 실온       (0.75×60□), 용출액은 증류수, 칼럼온도는 실온

(약 25℃), 유속은 0.5□/min, 검출은 210□에서의      (약 25℃), 유속은 0.5□/min, 검출은 210□에서의

흡광도(A210), 레인지(풀 스케일)은 0.04, 챠트          흡광도(A210), 레인지(풀 스케일)은 0.04, 챠트

스피드는 2.5□/min                             스피드는 2.5□/min

Ⅱ:GlcNAc2    Ⅲ:GlcNAc3    Ⅴ:GlcNAc5        Ⅱ:GlcNAc2    Ⅳ:GlcNAc4

[계산예]  그림-8. 11의 GlcNAc4→2GlcNAc2의 가수분해의 계산 예를 다음에 나타내었다.

GlcNAc4의 초속도는 0.1mM.

30분 후의 각 키토올리고당의 농도는 다음과 같이된다.

[GlcNAc4] = 8.43/8.25 = 0.102mM

[GlcNAc2] = 0.99/45.3 = 0.0432mM

계산법 1에서는,

f = (4×0.102+2×0.0432)/(4×0.1) = 1.24

계산법 2에서는 GlcNAc4로부터 2분자의 GlcNAc2가 생성되므로 GlcNAc2에 대해서는 1분자의 농도를 사용하여 계산하면,

f = (0.102+0.0432/2)/0.1 = 1.24

로 되어, 계산법 1과 2에서 f의 치가 같아진다. 따라서, GlcNAc4의 분해의 초속도는,

□4 = {0.1-(1/1/24)×0.102}/30 = 0.000582mM/min

= 0.582□M/min

GlcNAc5 → GlcNAc3+GlcNAc2의 반응에 있어서 경시 변화와 초속도의 효소 농도 의존성을 각각, 그림-8. 12와 그림-8. 13에 나타내었다. 그림-8. 12로부터 전체 반응의 작아짐과 함께 25%까지는 직선적으로 진행되는 것을 알 수 있다. 또한, 이 계산법으로 구한 초속도는 효소 농도에 비례하는 것을 알 수 있다.

그림-8. 12 차새우 키티나제에의한 GlcNAc5의  그림-8. 13 차새우 키티나제에의한 GlcNAc5의

가수분해 반응의 경시변화                    가수분해 반응의 초속도와 효소농도

효소 반응(GlcNAc5→GlcNAc3+GlcNAc5)를                   와의 관계

그림-8. 10의 HPLC 패턴으로부터 계산하였다          차새우의 간장에서 정제한 키티나제 19.5nM)을

(텍스트 참조). 전체 반응의 25%까지는 직선적         희석하고, 그 10□를, 0.1mM-GlcNAc5(50mM

으로 반응이 진행되는 것을 알 수 있다. 이             인산 완충액, pH 6.7) 100□에 가하고, 25℃에서

기울기로부터 초속도를 계산한다.                      반응하였다. 그림-8. 12에 나타낸 방법으로 초

속도를 구하였다. 초속도가 효소 농도에 비례

하는 것을 알 수 있다.

HPLC 분석에 있어서는 上記의 Tosoh TSK gel P200PW외에, 다음의 것과 같은 것이 있다(記述은 칼럼, 용출액, 칼럼 온도의 順).

1. Waters □-Bondapack carbohydrate column(0.39×30□),

acetonitrile/50mM sodium phosphate buffer, pH 5.6, 45℃.

2. Shimadzu PNH2-10   column(0.4×25□),

89% ethanol or 70% acetonitrile, 실온 or 30℃

8. 3. 4  엔도형 효소(키티나제)의 활성 염색

[원리]  효소용액을 전기 영동하고 겔 중의 단백질을 함유한 겔에 트란스브롯트한다. 그리고, 트란스브롯트한 겔 중에서 효소 반응한 후, 미 반응의 기질을 형광시약으로 발광시킨다. 효소는 검은 밴드로써 관찰된다.

[시약]  전기영동 겔 - 스란브형 폴리아크릴아마이드겔 디스크 전기영동(disc-PAGE) 또는 라우릴 황산나트륨 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)용 겔(85×45×1mm).

트란스 브롯트용 전기 영동 용액 - 374mM 트리스-염산 완충액(pH 8.9). SDS-PAGE의 경우는, 0.1% SDS를 함유한 50mM 트리스-384mM 글리신 완충액(pH 8.9)으로도 좋다.

SDS 제거 액 - 1% Triton X-100을 함유한 10mM 트리스-염산 완충액(pH 6∼8).

형광 완충액 - 0.01% Fluostain Ⅰ(드진 화학연구소)을 함유한 100mM 트리스-염산 완충액(pH 8.9).

[측정법]  효소를 전기영동한 후, 그 겔을 기질이 있는 겔에 트란스브롯타(세미드라이 형. AE-6670P/N, 아트 社)를 이용하여, 정전압 7.5V/□ 또는 정전류 80mA로 30분간 트란스브롯트한다. 그리고, 100mM 트리스-염산 완충액(pH 6∼8) 100□에 담그고 효소반응 한다. SDS-PAGE의 겔을 트란스브롯트한 경우는, SDS 제거액 100□로 2회(각 1시간, 실온) 세정하고, SDS를 제거하면서 효소반응 시킨다. 겔을 분리하고 형광 염색액에  5분간 담근 후, 증류수로 1시간 형광시약을 세정한다. 겔에 자외선 램프를 쬔다. 효소 밴드 이외는 청색으로 형광을 나타내고, 효소 밴드는 검게 관찰된다.

[결과 및 고찰]  누에의 외피로부터 추출한 엔도형 효소를  SDS-PAGE에 넣은 후, 활성 염색한 결과를 그림-8. 14에 나타내었다. 분자량 88kDa의 위치에 효소 활성 밴드가 검게 보인다. 효소 반응이 약할 때에는 형광 염색한 후, 증류수 또는 효소 반응에 적당한 완충액 중에 하룻밤 이상 방치하면 좋다. 효소 0.1□ 이하에서도 충분히 검출될 수 있다. disc-PAGE의 경우는 특히 문제는 없지만, SDS-PAGE의 경우, 산성 효소(등전점이 산성)의 경우는 어떻게 해서, 중성 또는 염기성 효소에서는 SDS 존재 중에서는(또한, Triton X-100으로 세정해도) 효소가 활성을 잃기 쉬우므로, 2-멜캅트에탄올의 첨가나, 샘플액의 증비 처리는 피하는 것이 좋다.

그림-8. 14  누에 키티나제의 활성염색

누에의 외피로부터 추출액을 SDS-PAGE에 넣은 후, 0.01%(W/V)글리콜 키틴을 함유한 스라브형 폴리아크릴아마이드 겔 헤트란 스프롯트하였다. 완충액 중에서 효소반응한 후에 미반응 기질을 형광 발색액(0.01% Fluostain I)을 이용하여  염색하였다. 레진 1∼3은 외피를 채집한 누에의 견화(繭化) 개시로부터의 일 수(그림-8. 15∼17도 같다). 3일째에 88kDa의 키티나제의 활성밴드가 검게 보인다.

8. 3. 5  엑소형 효소(□-N-아세틸글루코사미니다제)의 활성 염색

[원리]  효소 용액을 전기영동 후, 겔을 형광물질을 함유한 용액에 담그어 효소반응 시키면 겔 중의 효소 밴드가 발광한다.

[시약]  전기영동 겔 - 스라브형 disc-PAGE 또는 SDS-PAGE용 겔(85×45×1□).

SDS 제거액 - 1% Triton X-100을 함유한 10mM 트리스-염산 완충액(pH 6.0).

형광 기질 용액 - 50mM 인산 완충용액(pH 6.0)에 녹인 0.1mM-4-methylumbelliferyl-N- acetyl-□-D-glucosaminide(4Me Umb-□-GlcNAc) 용액.

[측정법]  효소를 전기영동 한 후, 겔을 형광 기질 용액에 담근다. SDS-PAGE의 경우, SDS 제거 액 100□로 2회(각 1시간, 실온) 세정하여 SDS를 제거한 후, 형광 기질 용액에 담근다. 2∼10분 후 겔에 자외선 램프를 쬐면, 효소 밴드는 청색으로 형광을 발한다.

[결과 및 고찰]  누에의 외피로부터 추출한 엑소형 효소를 SDS-PAGE에 넣은 후, 활성 염색한 결과를 그림-8. 15에 나타내었다. 분자량 67.5kDa의 위치에 효소 활성 밴드가 청색의 형광으로 빛나는 것이 보인다. disc-PAGE의 경우는 특히 문제는 없지만, SDS-PAGE에서는 활성을 잃기 쉬우므로, 2-멜캅토에탄올의 첨가나 샘플 액의 등비 처리는 피하는 것이 좋다.

그림-8. 15  누에의 엑소형 키틴 분해 효소의  활성 염색

누에 외피로부터의 추출 액을 SDS-PAGE에 넣은 후, SDS 제거 액(1% triton X-100)으로 세정하고, 형광 기질(4Me uMb-□-GlcNAc) 용액에 담궜다. 형광 밴드로써 효소 밴드가 보인다. 2, 3일 째에 67.5kDa의 활성 밴드(청색의 형광)가 보인다.

8. 3. 6  임뮤노 브롯팅(Western blot)

[원리]  효소 용액을 폴리아크릴아마이드겔에의해 전기 영동하고, 겔 중의 단백질을 단백질 흡착막에 트란스브롯트한다. 그래서, 막 위의 효소만을 항체로 인식·결합시켜, 그 항체를 프로브의 결합된 프로테인A 또는 2차 항체로 인식·결합시킨다. 목적의 효소는 이용한 프로브의 종류에 의해 각종 밴드로써 관찰된다.

여기에서는, 서양 와사비(겨자)의 파옥시다제를 결합시킨 프로테인A를 이용한 예를 소개한다. 밴드는 청자색으로써 관찰된다.

[시약]  바아오랏드社의 킷트가 이용되었다.

전기 영동 겔 - 스라브형 disc-PAGE 또는 SDS-PAGE용 겔(85×45×1□).

브롯팅 막 - 임모빌론 PVDF(immobilon polyvinylidene difluoride, 5×10□, 미리포아社)

트란스 브롯트용 전기 영동 용액 - 20mM 트리스-150mM글리신-20%메탄올(pH 8.5).

TBS 용액 - 500mM-NaCl을 함유한 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5).

브롯킹 용액 - TBS 용액으로 녹인 3% 젤라틴 용액(37℃로 올려서 녹인다).

TTBS 용액 - 0.05% Tween-20을 함유한 TBS 용액.

항체용 완충액 - TTBS 용액으로 녹인 1% 젤라틴 용액(37℃로 올려서 녹인다).

항체 용액 - 항체 완충액 100□에 적당히 희석한 항체(0.1∼1□의 혈청을 필요로 한다).

HRP 결합 프로테인A 용액 - 서양 와사비 파옥시다제 결합 프로테인A(Protein A- horseraldish peroxidase conjugate, Bio-Rad Laboratories) 0.5□을 증류수 1□로 녹이고, 그 10□를 항체용 완충액 100□에 녹인다.

HRP 발색 용액 - 사용 직전에 100□의 TBS 용액(실온)에 30% 과산화수소수(빙냉)60□를 녹이고, 이 용액에 60□의 HRP 발색시약(4-chloro-1-naphthol)을 빙냉 메탄올 20□에 녹인 것을 혼합한다.

그림-8. 16  누에 키티나제의 임뮤노 브롯팅

누에의 외피로부터의 추출액을 SDS-PAGE에 넣은 후, 임모빌론 막에 트란스 브롯트 한다. 그래서, 막위의 효소를 항체로 인식·결합시키고, 그 항체를 더욱 프로브의 결합된 프로테인A로 인식·결합시킨다. 그래서, 프로테인A로 결합한 파옥시다제의 효소 반응에 의해 청자색의 밴드로서 관찰한다. 항체는 88kDa의 누에 키티나제를 항원으로 하여 토끼에 의해 제작되었다. 3일째에 크게 88kDa의 키티나제의 밴드가 보인다.

그림-8. 17  누에의 엑소형 키틴 분해효소의 임뮤노 브롯팅

누에의 외피로부터의 추출액을 SDS-PAGE에 넣고, 그림-8. 16과 같이 조작한다. 단, 항체는 누에의 엑소형 키틴 분해효소(125kDa, 2量□)를 항원으로서 제작한 것. 1일째부터 67.5kDa의 sub유니트의 밴드가 보여지며, 2, 3일째에는 최대에 달한다.

[측정법]  기본적 조작은 바이오라드社의 프로트콜에 따른다. 또한, 각 조작은 전부 실온에서 페트리 접시 中 및 쉐이커로 교반하여 행한다.  효소를 전기영동 한 후, 그 겔 중의 단백질을 브롯팅막에 트란스 브롯타(세미드라이형, AE-6670P/N, 아트社)를 이용하여, 정전압 7.5V/□ 또는 정전류 80mA로 3시간 트란스브롯트 한다. 그래서, 그 막을 브롯킹 용액 100□ 중에서 45분간 교반하고, 막 상의 단백질이 놓여있지 않은 부분을 젤라틴으로 보호한다. TTBS 용액 100□로 2회(각 5분간) 세정 후, HRP 결합 프로테인A 용액 100□에 담궈서 1시간 교반한다. TTBS 용액 100□로 2회(각 5분간) 및 TBS 용액 100□로 5분간 세정 후, HRP 발색 용액 100□에 담궈서 30∼45분간 교반한다. 반응 후, 증류수로 충분히 씻는다.

[결과 및 고찰]  누에의 외피로부터 추출한 효소 용액을 SDS-PAGE에 넣은 후, 엔도형 효소(키티나제) 및 엑소형 효소(□-N-아세틸글루코사미니다제)로 제작한 항체를 이용해서 임뮤노 브롯트한 결과를 그림-8. 16 및 그림-8. 17에 나타내었다. 분자량 88kDa의 위치에 엔도형 효소, 67.5kDa의 위치에 엑소형 효소가 농자색의 밴드로써 보여진다. 이들 효소는 면역학적으로 항원성이 다르다는 것도 알 수 있다. 효소량은 0.1□만 있어도 충분히 선명한 밴드로서 관찰된다. 실험 조작이 많아서 좋은 데이터가 아닐 때는 문제이지만 그때는 ① 효소량, ② 항체의 역가, ③ 브롯팅 막에의 흡착, ④ HRP 기질 등에 대하여 개별적으로 조사할 필요가 있다. 니트로셀룰로오스막이 롯트에 의해 단백질 흡착 능이 낮은 것이 있으므로, 여기에서는 임모빌론 PVDF를 사용하였다.

8. 4  식물 키티나제

[원리]  식물 조직을 호모게나이즈 하고, 이것을 투석 또는 유안 염석하고, 조효소를 추출한다. N-아세틸키토산(재생 키틴)을 기질로 하고, 환원당량의 증가를 샤레스 변법으로 측정한다.

[시약]  효소 기질 - 키토산 1.6g을 2% 초산용액 200□에 첨가해서, 하룻밤 실온에 방치해서 완전히 용해시킨다. 여기에 메탄올 300□를 가해서 균일한 용액으로 한다. 무수초산 5□(헥소사민 잔기 당 3∼5몰 等량)를 잘 혼합하면서 첨가한다. 30분 이내에 겔화하고, 하룻밤 방치한다. 겔을 부수고, 0.5N-NaOH로 중화하고, 믹서로 호모게나이즈하여 완전히 중화한다. 겔을 여과하여 모으고, 증류수에 침적하고 여과해서 여액이 중성이 될 때까지 세정한다. 침전을 에탄올 약 700□에 침적하고, 하룻밤 실온에 방치한다. 침전을 여과, 풍건, 감압건조한다. 이것을 분쇄기로 분쇄하여 120메쉬 劃分을 모은다. 이것이 N-아세틸기 치환도 1.0의 N-아세틸 키토산(재생 키틴)이다*.

샤레스 변법 시약 - K3Fe(CN)6 0.5g을 0.5M-NaCO3 용액 1□에 용해하고, 어두운 곳에 보관한다.

[효소의 추출]  카르스, 잎, 뿌리, 종자, 수목 등 신선한 일반식물세포, 조직, 개체를 이용한다. 청평한 신선식물 시료 1∼5g을 빙냉한 0.02M-citric acid-0.04M-Na2HPO4 완충액(pH 6.8)*1 20∼50□ 중에서 호모게나이즈(히스코트론 NS-10)하고, 원심분리(1,500×g, 30분, 4℃)한다*2. 상등액을 투석 튜브에 넣고, 같은 희석액 1,000□ 중에서 4℃로 하여 18시간 투석한다. 불용물을 원심분리(1,600×g, 20분, 4℃)로 제거하고 상등액을 같은 완충액으로 일정용량으로 하여 조효소 추출액으로 한다.

* : 이 재생 키틴은, 水불용 기질로써 이용되는 콜로이드 키틴과 거의 같은 효소 분해성을

나타낸다. 또한, 수용성 기질로서 카르복시메칠 키틴, 글리콜 키틴 등이 있다.

*1 : 식물 키티나제의 최적 pH는 3.3으로 비교적 낮은 것에서 8.0의 높은 것까지 존재한다

(표-8. 1). 식물에 의해 추출 완충액의 pH를 조정해야 한다. 여기에서는 양배추 잎 키티

나제의 최적 pH 6.8에서 행하였다.

*2 : 착색된 추출액 등은 다음 조작의 사이에 유안염석(20∼80%)을 가하면 좋은 결과가 얻어

진다. 즉, 상등액을 빙냉각 하여 20% 유안 농도로 하고, 생성된 침전을 원심분리(16,000

×g, 20분, 4℃)로 제거한다. 상등액을 80% 유안 농도로 조정하고, 생성된 침전을 원심

분리로 모은다. 이 침전을 가능한 한 소량의 완충액에 용해한다.

*3 : 키티나제 효소는, 비등 수욕 중에서 10분간 처리로 완전히 失活되지 않는다. 이 탈단백질

조작으로, 효소 반응은 거의 완전하게 정지한다. 또한, 환원당의 측정에도 거의 저해는

보여지지 않는다.

한편, 신선조직 약 0.5g을 청평하고, 70℃에서 1시간 예비건조, 이어서 P2O5 상에서 5시간 감압 건조한다. 데시게이터 중에서 실리카겔 上, 40분간 방냉하고 중량을 측정하여 수분 함량을 산출한다.

[효소활성 측정법]  기질로써 재생키틴 20.0□을 0.05M 크엔산-0.1M-Na2HPO4 완충액(pH 6.8) 2□에 현탁하고, 조효소 추출액 1.0□를 가한다. 이 반응액을 37℃에서 1시간 진탕반응 시킨다. 효소 반응은 탈단백劑인 10%텅스텐산-2/3N황산(1:1, v/v) 혼액 1□를 첨가하여 정지시킨다*3. 이어서, 불용의 기질과 변성 단백질을 원심분리(1,500×g, 15분, 4℃)로 제거한다. 시험관에 샤레스 변법 2.0□를 취하고, 효소반응 상등액 1.5□를 가해서 혼합한다. 管口를 글라스玉으로 뚜껑을 하고, 정확히 15분간 비등 수욕 중에서 가열한다. 실온으로 냉각 후, 420□에서 흡광도의 감소를 측정한다. N-아세틸-D-글루코사민으로서 25∼90□/□의 측정이 가능하다. 그래서, 조효소 추출액과 완충액만을 똑같이 처리하고, 생성되는 유리 환원당량을 블랭크로서 공제한다. 효소 1단위는 37℃에서 1분간에 1□mol의 N-아세틸-D-글루코사민에 상당하는 환원력을 유리시키는 양으로 한다.

표-8. 1  식물 키티나제의 특성

	분자량 (×103)	등전점 (PI)	단백질 성 분	최적온도 (℃)	최적 pH	반응 형
참마 완두콩 소맥 배아 대두 양배추 감자피	33.5 22∼30 30∼33 32 54∼60 30	3.8∼4.1 7.5∼9.2	3 다성분 5 Ｂ1	20∼60 30 45	3.5∼8.0 6.5 7 3.3∼4.0 6.8 6.5	엔도 엔도 엔도 엔도 엔도

[측정 결과]  2, 3의 측정 결과를 표-8. 2에 나타내었다.

표-8. 2   2, 3 식물에 있어서 키티나제 효소 활성

식 물	키티나제 활성(U)a	식 물	키티나제 활성(U)a
벼 카르스b 무 잎 카르스b 대두 카르스b 양배추 잎 카르스b 메론 잎 카르스b 흑송 종자 흑송 유아c 무 종자 무 유아c 대두 종자 대두 유아c 금어초 樹皮 목심부(木芯部) 잎	120(11) 65 59 1.9 6.8(0.07) 35(1.7) 15(0.15) 6.4(0.68) 0.9(0.01) 0.9(0.05) 2.0 1.0 2.6	니리노끼 수 피 목심부 잎 메밀 잣 밤나무 수피 목심부 잎 금넉줄고사리 잎 수피 목심부 잎 조릿대(작은 대나무)	9.6 0.1 5.0 1.1 0.1 0.1 0.8 0.4 1.2 4.0

a : 신선 중량 100g 당의 키티나제 효소활성. ( )안에 건조물 중량 g 당의 키티나제 효소활성을 나타내었다.     b : 배양일수 20일간의 카르스를 분석하였다.    c : 발아 후 4∼7일간의 幼芽를 분석하였다.