제 7 장  헤테로-N-아세틸키토올리고당의 조제

N-아세틸글루코사민과 글루코사민으로 구성된 헤테로-N-아세틸키토올리고당의 유효한 조제법은 아직 없지만, 효소분해를 이용하여 중합도 2∼4인 올리고당이 간단하게 조제된다. 이것은 아세틸화도 20∼45%의 키토산이 키토사나제 뿐만 아니라 각종 미생물 기원의 키티나제에 의해서도 잘 분해된다는 것에 기초한 방법이다. 생성된 올리고당은 CM-세파덱스 등의 양이온 교환체를 이용한 1회의 크로마토그라피로 용이하게 분리할 수 있으며, 그 순도는 비교적 높다. 본 장에서는 34% N-아세틸화 키토산을 Aeromonas hydrophila 키토사나제를 이용하여 분해하고 헤테로-N-아세틸키토올리고당을 조제하는 방법 및 그들 올리고당의 간단한 당 배열의 결정에 대해서 서술한다.

7. 2  부분 N-아세틸화 키토산의 키티나제에 의한 분해

【재료】 부분 N-아세틸화 키토산 - 일반적으로 아세틸화도 20∼35% 정도의 키토산을 기질로 한다.

미생물 키티나제 - Streptomyces griseus 키티나제(Sigma) 또는 Aeromonas hydrophila 키티나제(合同酒精)를 사용한다. 그 외의 시판 미생물 키티나제도 사용할 수 있다고 생각되는데, 필자는 아직 그들 효소에 대해서 데이터를 갖고 있지 않으므로 언급 할 수는 없다.

【실험결과】 0.1M 초산완충액(pH5.0)에 녹인 0.6%의 34% N-아세틸화 키토산 용액 500□에 Aeromonas hydrophila 키티나제 10□(1.31 단위, 활성 측정법은 8.2.4 참조) 및 2.06% NaN3를 가하여 37℃에서 48시간 반응시킨다. 여기에, 7.5□(0.98 단위)의 키티나제를 가하여 37℃에서 48시간 반응시켜 키토산을 분해하는(효소의 추가로 분해율은 약 4% 상승한다). 반응은 5분간 가열하여 정지한다. 96시간 후의 키토산의 가수분해율은 환원당의 정량(8.2.4 참조)에 의해 24.8%이었다. 반응액에 0.1N 가성소다를 가하여 pH9.4로 조절하고 미분해의 고분자량 침전물을 원심분리로 제거하고 상등액(615□)은 1N 초산을 가하여 pH를 5.0으로 다시 맞춘다. 그것의 약 절반 가량(340□를 35℃이하에서 23□로 감압농축하고 전기투석(Micro Acilyzer G1, 旭化成工業)으로 탈염하고 다음의 올리고당의 분리에 사용하였다. Streptomyces griseus 키티나제의 경우도 똑같이 반응시켜 가수분해액을 얻을 수가 있다.

7. 3  칼럼크로마토그라피에 의한 올리고당의 분리

【고속액체 크로마토그라피】 (이하 고속액 크로라고 略記한다) 올리고당의 검출에는 적당한 고속액크로 장치를 사용한다. 칼럼에 Radial-PAK□Bondapak-NH2(8.0×100mm, Waters Associates) 등, 용액으로써 아세토니트릴-水系(조성 75:25 ∼ 70:30)를 이용한다. 검출은 UV(210nm) 또는 굴절율의 측정에 의한다.

【실험결과】 올리고당을 함유한 투석액(환원당으로써 294□)을 미리 0.01M 초산완충액 (pH5.0)으로 평형화한 CM-세파덱스 C-25의 칼럼(2.6×47.0cm)로 흡착하였다. 미흡착의 N-아세틸화 당을 0.01M 초산완충액(pH5.0)으로 용출시킨 후, 흡착한 올리고당은 같은 완충액 중에서 0∼1.0M의 염화나트륨의 농도 구배를 이용하여 용출한다.

그림-7.1에 그 용출 패턴을 나타내었다. 분리된 F-1부터 F-11까지의 각각의 피크를 모아 35℃ 이하에서 감압농축하고 탈염한 후, 동결건조한다. 회수된 주된 올리고당의 수량은 환원당으로써 F-1 41.9□, F-2 12.0□, F-3 36.0□, F-4 46.4□이었고, F-1부터 F-11까지의 수량은 첨가한 환원당량의 약 67%에 달하였다. F-1은 3□의 물에 녹이고, 트요펄 HW-40F 칼럼(2.6×86.5cm)에 첨가하고 물을 용매로써 겔 여과를 행하면 그림-7.2와 같이 F-1과 F-1-2로 분리된다. 각각의 획분을 모아 똑같이 처리하여 동결건조한다.

그림-7.3에 나타내었듯이, 분리된 F-1-1, F-1-2, F-2, F-3 및 F-4는 고속액크로로 거의 균일하며 비교적 순도 높은 제품이 얻어졌다. 그러나, F-5부터 F-11까지의 획분은 복수의 성분으로 되어있어 더욱 정제가 필요하다. 또한, Streptomyces griseus 키티나제에 의한 부분 N-아세틸화 키토산의 분해에서도 그림-7.1에 유사한 용출패턴이 얻어졌는데, F-3의 수량이 현저하게 크다는 것이 특징이었다.

그림-7. 1  부분 N-아세틸화 키토산의 효소분해에 의해 생성된 올리고당의 CM-세파덱스 C-25 칼럼크로마토그라피에 의한 분리

-●- : 글루코사민    --- : 염화나트륨

GlcN을 1mol 함유한 헤테로-N-아세틸키토올리고당은 4당, 3당, 2당의 순서로 용출된다.

그림-7. 2  F-1의 트요펄 HW-40F에의한 겔여과

-●- : 글루코사민

그림-7. 3  주된 획분의 고속액 크로에 의한

순도 검정

칼럼 : Radial PAK□Bondapak-NH2

(8.0×100mm)

용매 : 아세토니트릴-水(73:27)

유속 : 2□/min   검출 : UV210nm

7. 2  올리고당의 당 잔기 수와 효소법에 의한 올리고당의 당 배열의 결정

【재료】 표준(GlcNAc)n--- N-아세틸글루코사민의 올리고머

□-N-아세틸글루코사미니다제(□-GlcNAcase)-Pycnoporus cinnabarinus IFO 6139로부터 조제한다. 기타 시판의 효소제품도 사용할 수 있다고 생각되지만 미리 그 활성을 체크해 둘 필요가 있다.

엑소-□-글루코사미니다제(□-GlcNase) --- Nocardia orientalis IFO 12806으로부터 조제한다. 현재로써는 이 효소제품 밖에 없다.

【올리고당의 N-아세틸화】 올리고당 1□(3□)를 메탄올 0.8□, Dowex 1(×8, HCO3-) 1□, 무수초산 12.5□와 氷溫 하에서 혼합하고 혼합물을 0∼5℃에서 교반하면서 1.5시간 유지한다. 수지를 제거하여 물로 5회 세정하고 세정액을 최초의 혼합액과 합쳐 Dowex 50(×2, H+, 2□)의 칼럼을 통한다. 용출액은 증발건조하여 시료로 한다. 시료는 고속액크로를 이용하여 표준(GlcNAc)n과 비교하여 헤테로-N-아세틸키토올리고당의 당 잔기수를 추정한다.

【올리고당의 엑소-□-글루코시다제 분해】 0.4%올리고당 100□, 0.04M 인산 완충액(pH5.5) 50□, P. cinnabarinus □-GlcNAcase(0.1 단위) 또는 N. orientalis □-GlcNase(0.025 단위) 50□를 함유한 반응액을 37℃에서 1 및 20시간 반응시킨다. 반응정지 후, 생성 당을 고속액크로를 이용하여 검출하고 비환원말단의 구성당을 결정한다.

【실험결과】 고속액크로로 각 올리고당의 용출위치를 표준(GlcNAc)n의 용출위치와 비교하였다. 그 결과, N-아세틸화당의 F-1-1과 F-1-2는 각각 (GlcNAc)2와 GlcNAc인 것으로 추정되었다. F-2, F-3 및 F-4는 각각 (GlcNAc)4, (GlcNAc)3 및 (GlcNAc)2 보다 서서히 느리게 용출되었다. 그러나, F-2, F-3, F-4를 M-아세틸화하면 각각 (GlcNAc)4, (GlcNAc)3 및 (GlcNAc)2와 동일한 용출위치에 용출되므로, 모두 GlcNAc와 GlcN으로 된 헤테로-N-아세틸키토올리고당이며, 그들의 당 잔기 수는 각각 4, 3 및 2인 것으로 추정된다.

다음으로 각 올리고당의 비환원말단의 당단기를 엑소-□-글루코시다제를 이용하여 결정하였다. 먼저 □-GlcNAcase를 작용시키면 그림-7.4에 나타내었듯이 F-1-1은 완전히 GlcNAc로 분해된(A). 또한, F-2는 GlcNAc와 3당인 F-3으로 완전히 분해된(B), F-3은 그 일부만이 GlcNAc와 F-4로 분해된 것이(C), F-4는 전혀 분해되지 않았다(D). 이것에 대해서, □-GlcNase를 작용시킨 경우는 그림-7.5에 나타내었듯이, N-아세틸화당인 F-1-1은 전혀 그 작용을 받지않고(A), F-2도 분해되지 않았다(B). 또한, F-3의 대부분은 GlcN과 (GlcNAc)2로 분해되고(C), F-4는 당몰의 GlcN과 GlcNAc로 분해되었다(D). 이들의 결과로부터, 헤테로-N-아세틸키토올리고당 중 F-2는 비환원말단이 GlcNAc의 4당이며, F-3은 비환원말단이 GlcNAc 또는 GlcN 으로 된 3당의 혼합물이며, F-4는 비환원말단이 GlcN, 환원말단이 GlcNAc인 2당인 것으로 결정되었다.

그림-7. 4  F-1-1(A), F-2(B), F-3(C) 및 F-4(D)의 P. cinnabarinus □-GlcNAcase에 의한 분해물의 고속액크로에 의한 검출

용매에 아세토니트릴-水(71:29)를 이용한 이외는 그림-7.3의 조건과 동일

그림-7. 5  F-1-1(A), F-2(B), F-3(C) 및 F-4(D)의 N. orientalis □-GlcNase에 의한 분해물의 고속액 크로에 의한 검출

용매에 아세토니트릴-水(75:25), 검출에 굴절율을 사용한 이외는 그림-7.3의 조건과 동일

7. 5  아질산 분해에 의한 올리고당의 당 배열의 결정

【올리고당의 아질산 분해】 표-7.1에 나타내었듯이, 아질산 분해는, 올리고당 분자 중의 GlcN을 2,5-안하이드로만노스, 글루코사미니톨(GlcNol)을 2-데옥시글루코스로 변화시키지만, GlcNAc나 GlcNAcol은 변화시키지 않는 것에 기초하여 올리고당의 당 배열을 결정하는 데에 이용한다. 올리고당 1□(2∼3□)에 약 10□의 수소화불소나트륨을 가하여 4℃에서 20분간 유지한다. 과잉의 수소화불소나트륨을 초산을 가하여 분해하고, 증발건조 후, 잔사에 메탄올을 가하는 것을 반복하고 감압하여 메탄올을 증발시켜 불소산을 제거한다. 잔사에 10%아질산나트륨 0.5□, 33% 초산 0.5□를 가하여 25℃에서 2시간 보온하여 분해한다. 분해액은 Dowex 50(×2, H+, 5□) 및 Dowex 1 (×8, HCO3-, 5□)의 칼럼을 통과시킨 후 증발건조한다. 분해생성물은 다시 수소화불소나트륨으로 환원하여, Dowex 50(×2, H+, 5□)의 칼럼을 통한다. 용출액은 증발건조 후 시료로 하고, 환원된 분해 생성물을 고속액크로로 검출한다.

표-7. 1  GlcN을 1mol 함유한 헤테로-N-아세틸키토올리고당과 그것들의 아질산 분해에 의한 생성물

GlcN·GlcNAcol GlcNAc·GlcNol GlcN·GlcNAc·GlcNAcol GlcNAc·GlcN·GlcNAcol GlcNAc·GlcNAc·GlcNol GlcN·GlcNAc·GlcNAc·GlcNAcol GlcNAc·GlcN·GlcNAc·GlcNAcol GlcNAc·GlcNAc·GlcN·GlcNAcol GlcNAc·GlcNAc·GlcNAc·GlcNol	→ → → → → → → → →	M + GlcNAcol GlcNAc·dGlc M + GlcNAc·GlcNAcol GlcNAc·M + GlcNAcol GlcNAc·GlcNAc·dGlc M + GlcNAc·GlcNAc·GlcNAcol GlcNAc·M + GlcNAc·GlcNAcol GlcNAc·GlcNAc·M + GlcNAcol GlcNAc·GlcNAc·GlcNAc·dGlc

GlcNAcol : N-아세틸글루코사미니톨         GlcNol : 글루코사미니톨

M : 2,5-안히드로만노스                dGlc : 2-데옥시글루코스

【실험결과】 각 올리고당의 아질산분해 결과는 그림-7.6에 나타내었다. 즉, F-2는 미지생물(아마 N-아세틸글루코미닐-2,5-안히드로만노스)과 N-디아세틸키토비이톨로 분해되며(A), F-3은 주로 2,5-안히드로만노스와 N-디아세틸키토비이톨과 함께, 소량의 상기 미지생물과 N-아세틸글루코사미니톨로 분해되며(B), F-4는 2,5-안히드로만노스와 N-아세틸글루코사미니톨로 분해되었다(C). 표-7.1에 GlcN을 1mol 함유한 경우의 헤테로-N-아세틸키토올리고당의 당 배열과 그것들의 아질산 분해 생성물을 나타내었다. 엑소-□-