제6장

N-아세틸글루코사민 또는 글루코사민 올리고당의 調製·分劃

제6장 N-아세틸글루코사민 또는 글루코사민의

올리고당의 조제·분획

요즘 생리활성을 가진 비교적 고중합도의 키틴 및 키토산 올리고당이 나오고 있다. 즉 헥사-N-아세틸키토헥사오스(GlcNAc6)가 마우스에 대해서는 면역기능 증진효과와 항종양활성을 그리고 식물에 대해서는 메론의 키티나제가 활성유도인자로서의 에리시터 활성을 갖고 있다는 것 등을 알아냈다. 또한, 키토산올리고당(GlcN4-6)이 토마토잎의 프로테아제 저해제 합성의 유도인자로써 키토헵타오스(GlcN7)가 식물병원균 Fusarium Solani에 대한 에리시터 활성을 갖는다는 것 등이 보고되었다.

이러한 배경으로부터 이들 올리고당의 간이적 조제법에도 관심이 모아지고 있다. 일반적으로 이러한 종류의 올리고당을 얻기 위해서는 키틴이나 키토산을 한정 가수분해후 분해물을 활성탄 칼럼크로마토그라피로 분리하는 방법이 사용되어왔다. 그러나 이 방법은 비교적 고중합도인 5이상의 올리고당을 얻기 위해서는 효율적인 방법이라고는 할 수 없다. 그래서 최근에는 가수분해효소에 의한 올리고당의 조제법도 왕성하게 취해져 오게 되었다.

이 장에서는 키틴·키토산 올리고당의 조제에 관한 화학법과 효소법에 대한 知見을 소개한다.

6.1 화학적방법

6.1.1 키틴 올리고당

키틴올리고당의 조제법에 대해서는 오랫동안 Rupley등에 의한 키틴의 한정 염산 가수분해에 의한 방법이 널리 이용되어져 왔다. 최근에는 불화수소를 이용한 키틴분해의 개량법이 보고 되었지만 불화수소의 사용은 대량조제를 하는데는 부적당하다. 여기에는 Rupley의 방법에 준한 조제법을 서술하겠다.

[원리] 키틴을 농염산으로 일정시간 水解하고 중화후 반응액을 활성탄 칼람에 흡착시키고 에탄올로 용출시켜 일련의 중합도 2∼7의 올리고당을 얻는다.

[방법] 키틴 분말(20메쉬 분말품) 25g을 농염산 600□에 가하고 40℃에서 3시간 교반하면서 가수분해를 하였다. 분해종료 후, 동용량의 물로 희석하고 25% 수산화나트륨 용액으로 pH7.0가지 중화 하였다. 이 중화액을 직접 활성탄-셀라이드(1:1) 칼럼크로마토그래피에 넣고 충분량의 물로 세정하였다. 흡착한 올리고당을 0∼50%에탄올 직선농도구배에 의해 GlcNAc2-GlcNAc6의 중합도에 따른 相堂화분을 순차적으로 용출시켰다.(그림-6.1) 각각의 화분을 농축 동결건조 하여 GlcNAc2 1.2g, GlcNAc3 1.9g, GlcNAc4 1.6g, GlcNAc5 0.8g, GlcNAc6 0.3g을 얻었다.

그림-6.1 활성탄-셀라이트 칼럼에 의한 키틴올리고당의 분리

칼럼 : 활성탄-셀라이트 칼럼, 4.4×100□

용출액 : 수성에탄올, 10∼30% 직선농도 구배

검출 : UV검출기

[평가] 키틴올리고당을 얻기위한 가수분해는 염산농도, 온도, 반응시간에 의해 크게 영향 받는다. 이 때의 반응온도는 아세틸기의 가수분해를 가능한한 억제하기 위해 40℃에서 행하였다. 표-6.1에 나타내었듯이 반응의 진행에 따라 저중합도 올리고당 GlcNAc2, GlcNAc3의 생성은 증가하지만 고중합도 GlcNAc5, GlcNAc6의 것은 감소하는 경향을 나타내었다. 이 경우 중합도가 높은 올리고당을 얻기위해서는 40℃에서 2시간 정도의 분해가 최적이며 30℃에서 행할 경우에는 6시간에서 동정도의 결과가 얻어졌다.

조성비율(%)	40℃				30℃
성분명 시간	1.5	2	2.5	3	2	4	6
GlcNAc	0.61	1.60	1.22	4.66	4.09	2.50	0.32
GlcNAc2	19.06	19.83	26.70	30.04	14.99	17.34	17.57
GlcNAc3	23.40	23.01	26.97	26.87	21.95	18.90	23.41
GlcNAc4	22.84	22.42	21.99	19.97	24.19	18.72	23.92
GlcNAc5	20.12	19.40	14.09	12.92	23.91	22.44	23.64
GlcNAc6	13.97	13.74	9.04	5.54	10.52	20.10	11.15
收量	34.6	44.6	46.4	49.8	8.4	17.5	45.3

*수량 : 키틴 125g으로 부터의 收量

6.1.2 키토산 올리고당

산가수분해에 의한 키토산 올리고당의 조제는 Horowitz등에 의해 행하여졌다. 분해법은 키토산에 대해 다량의 염산을 이용하며 장시간을 요한다. 여기서는 이 점을 개량한 坂井등의 효율적 키토산올리고당의 조제법을 소개한다.

[원리] 그림-6.2에 키토산 올리고당의 조제 스킴을 나타내었다. 키틴 올리고당과의 조제법의 차이는 산가수분해후 중화공정이 없지만 분리공정에서 키토산 올리고당이 유리아미노기를 갖고 있으므로 이온교환 크로마토그래피를 이용하는 것이다.

그림-6.2 키토산올리고당의 조정 스켐

[방법] 키토산 25g에 250□의 농염산을 가하고 80℃ 2시간 가수분해 하였다. 이 분해액의 불용물을 원심분리로 제거하고 상청액에 활성탄을 가해서 탈색 후 감압농축건고 하였다. 이 분해물에 메탄올 200□를 가하고 실온에서 2시간 교반후 흡인여과로 불용물을 제거 여액을 감압농축 건고하였다. 여기에서 메탄올의 용해분리에 의해 14.5g의 키토산의 부분 분해물을 얻었다. 이 부분분해물 3.0g을 물에 용해하고 200□의 이온교환수지 칼럼(Dowex 50wOH- form)에 흡착시키고 염산농도를 순차로 1.15N(150□), 1.81N(300□), 2.54N(400□)로 단계적으로 상승시켜 용출하였다.(그림-6.3)

그림-6.3 이온교환 크로마토에 의한 키토산 올리고당의 분리

칼럼 : Dowex50w 칼럼, 2.2×30□

용출액 : 3단계 염산농도에 의한 용출

검출 : 닌하이드린법

키토산 올리고당의 검출은 닌하이드린 발색으로 50□의 흡광도를 측정하여 행하고 일련의 키토산올리고당을 순화한다. 그 결과 D-글루코사민 염산염(GlcN1HCl) 0.25g(8.3%, 키토산 올리고당 혼합물 3g으로 부터의 수율), 키토비오스 염산염(GlcN2HCl) 0.82g(27.3%), 키토트리오스 염산염(GlcN3HCl)0.62g(20.7%), 키토테트라오스 염산염(GlcN4HCl)0.14g(4.7%), 키토펜타오스 염산염(GlcN5HCl)0.10g(3.3%), 키토헥사오스 염산염(GlcN6HCl)0.05g(1.7%)을 얻었다.

[평가] 상기 반응조건에 기초해서 산분해를 행하면 4시간 이상의 반응에서는 올리고당의 수율이 저하되어 단당 GlcN1이 현저하게 증대한다. 이처럼 다량으로 생성된 본 단당의 존재는 다음의 올리고당의 분리공정의 효율을 저하시키는 원인이 되므로 이 단당을 미리 제거하는 방법을 검토하였다. 그 결과 단당만이 메탄올에 대하여 용해도가 낮은(0.4%)점에 착안하여 이 성질을 이용해서 위에 서술한 메탄올 용해분리조작을 행하였다.

이 단당제거조작에 의해 칼람규모의 축소화를 도모할 수 있었다. 그렇지만 키토산 올리고당도 키틴올리고당과 같이 산가수분해법으로는 고중합도의 올리고당의 양산에는 한계가 있는 것이 현상이다.

6.2 효소적 방법

6.2.1 키틴올리고당

키틴의 효소분해에는 키티나제와 □-N-아세틸글루코사미니다제가 관여하고 있다. 미생물이 생산하는 키티나제는 키틴에 대해서 거의 엔도형으로 작용하여 키틴올리고당에 대해서는 이당 단위로 가수분해하는 것이 많다. 한편, □-N-아세틸헥소사미니다제는 키틴 올리고당 및 GlcNAc2에 엑소형으로 작용하여 그의 비환원 말단에 의해 GlcNAc를 유리한다.

여기에서는 호열세균에 의한 GlcNAc2의 특이한 생산법, 키틴분해 효소인 키티나제와 리조치움의 당전이 반응을 이용한 저중합도에서 고중합도 올리고당의 합성 더나아가 리조치움에 의한 아그리콘部에 p-니트로페닐기를 가진 키토올리고당의 합성법을 소개한다.

(1) 디-N-아세틸 키토비오스

GlcNAc2는 □-N-아세틸글루코사미니다제의 기질 렉친저해제 생리활성 올리고당 GlcNAc6과 GlcNAc7의 효소에 의한 당전이 반응의 기질, 더 나아가 복합당질의 당쇄합성의 출발물질 등에 이용된다.

[원리] 호열성 키틴 분해세균을 키틴을 함유한 배지에서 진탕배양하고 그 과정에서 분해 생성된 GlcNAc2를 배양액으로부터 크로마토에 의해 분리한다.

[재료] 키틴 200g을 12M염산 500g에 교반하면서 실온에서 서서히 가했다. 이것을 30∼40분 초음파처리(27□)후, 5□ 빙수중에 주입하고 급속교반하면서 미립자상의 키틴을 석출시켰다. 생성된 침전을 5℃에서 하룻밤 방치 후 글래스필터상에서 순차적으로 침전한 것을 물 세정, 수산화나트륨 용액으로 중화, 최종적으로 중성이 될 때까지 충분히 물 세정을 하여 염free의 콜로이달 키틴을 조제한다.

[供試菌株] 온천에서 분리한 호열성 키틴 분해세균 Bacillus licheniformis x-7□를 사용한다.

[방법] 이온교환수 1□당 콜로이달 키틴 15g, NH4NO3 2g, Na2HPO4·12H2O 3.4g, KH2PO4 1g, NaCl 0.5g, MgSO4·7H2O 0.5g, CaCl2·2H2O 0.1g, 효모엑기스 0.5g의 배지(pH7.0) 50□를 함유한 500□ 삼각플라스크에 初發菌농도가 4×106cells/□로 되도록 접종하고 50℃에서 회전진탕배양(5□, 150rpm)하였다. 배양 3.5일재에서 GlcNAc2 9.8g/□가 배양액에 축적되고 소량의 GlcNAc3 0.2g/□도 함유한다. 그림=6.4는 배양온도를 40∼50℃의 범위에서 GlcNAc2의 측적량의 경시변화를 조사한 결과이다. 상기조건하에서 4일간 배양한 GlcNAc2농도 9.5g/□의 배양액 100□를 이용하여 본 이당의 분리를 행하였다. 배양액을 원심분리에 의해 균체 및 잔존 키틴을 제거한 후 그 상청액을 한외여과(아미콘 PM10, 분화 분자량 10,000)를 하였다. 여액을 활성탄 칼럼(2.2×30□)에 넣어 GlcNAc2를 흡착시키고, 이온교환수로 충분히 칼럼을 세정 후 10% 에탄올로 GlcNAc2를 회수하였다. 이 용출화분을 농축건고 하면 백색결정 0.75g이 얻어진다. 배양액으로 부터의 GlcNAc2의 회수율은 79%이었다.

그림-6.4 GlcNAc2 생산에 있어서 배양농도의 영향

[배양온도(℃)] ○:40 ●:50 △:55 ▲:60

[평가] ?口와 島原은 당초, 중온성세균 Vibrio anguillarum E-383을 이용한 키틴분해에 의해 GlcNAc2의 조제법을 보고하여 종래의 산분해법에 비해 수율 및 선택성이 높다는 점에서 우수하다는 것을 나타내었다. 그렇지만 본법은 배양일수가 16일간으로 장기를 요하는 단점이 있다. 그래서 호열성 세균 B.licheniformis를 이용함으로써 배양시간을 대폭 단축할 수 있다. 이 경우의 배양액으로 부터의 GlcNAc2의 회수방법으로서 상기에서 나타낸 활성탄칼럼 크로마토로 부터의 분리법과는 별도로 피리딘을 가해 GlcNAc2를 옥타아세테이트 유도체로 변환하고 클로로포름으로 추출 이 농축시럽을 실리카겔 칼럼 크로마토를 행한 분리법이 있다.

(2) 키티나제에 의한 헥사-N-아세틸키토헥사오스의 합성

[원리] 키티나제를 인위적 억제하(고기질농도, 유안첨가)에서 GlcNAc4와 반응시켜 이 당쇄연장반응에 의해 GlcNAc6를 합성하고 칼람크로마토그라피로 분리한다.

[재료]Nocardia orientalis IFO 12806 株의 배양액을 硫安分화 후 순차적으로 CM-Sephadex C-50, Bio-Gel P-60의해 칼럼크로마토그라피, Phenyl-Sepharose CL4B 疎水 크로마토그라피를 하여 키토올리고당에 대해서 당전이능을 가진 키티나제 포품을 얻었다.

[효소활성] 콜로이달 키틴 1□에 적당량의 효소액과 0.2M 초산완충액(pH 5.5)을 가해서 전량을 2□로 하고 660□의 흡광도가 1.5가 되도록 조제하여 40℃에서 10분간 진탕반응을 하였다. 증비로써 반응정지하고 원심분리하여 불용물을 제거하였다. 상청액 1□에 Schale시약* 3□를 가하여 15분간 증비후 급냉하고 420□의 흡광도를 측정하였다. 효소활성 1유니트(U)는 1□□의 N-아세틸글루코사민 당량의 환원력을 생성하는 효소량으로 정의하였다.

[방법] GlcNAc4 200□를 20% 유안을 함유한 50mM 초산완충액(pH 5.5) 4□에 용해하였다. 이 용액에 0.8U 키티나제를 가하고 40℃에서 24시간 방치하였다. 반응액은 시간의경과에 따라서 백탁되고 얼마안가서 침전을 생성한다. 생성된 침전을 원심분리에 의해 모으고 20% 유안 5□로 세정하였다. 이 침전을 5□의 물에 용해 후 Bio-Gel P-4(200∼400메쉬)칼럼에 넣어 겔여과를 행하였다. 그림-6.5에 나타내었듯이 용출위치의 최초에 출현하는 주 피크를 分劃하여 농축, 동결건조하여 49□의 GlcNAc6을 얻었다. 이것은 기질당 34%의 전환율이다.

[평가] 본 반응계와 같은 고염농도하에서는 이당쇄연장반응에 의한 GlcNAc6형성에 따라서 그의 용해도가 낮아져서 용이하게 석출, 침전을 생성한다. 또한 이 경우의 20% 유안첨가는 무첨가에 비해서 육당의 최대생성량이 1.6배 증가하였다.

* : 0.5g의 페리시안화칼륨을 0.5M 탄산나트륨용액 1□에 용해한 것

그림-6.5 키티나제 작용에 의한 당전이 생성물의 겔여과에 의한 분리

칼럼 : Bio-Gel P-4 칼럼, 2.6×95□(50℃로 칼럼 보온)

용출액 : 水, 유속 60□/h

검출 : UV검출기

1∼7 : 표준 키토올리고당의 각 중합도에 대응한 용출위치

그렇지만 그 최대생성에 달하는 시간은 2배를 요한다. 본 반응효율은 유안농도의 온도, 기질농도에 의존하고 있다.

(3) 리조치움에 의한 헥사-N-아세틸키토헥사오스와 헵타-N-아세틸키토헵타오스의 합성

상기 키티나제에 의한 GlcNAc4로부터 GlcNAc6에의 합성반응은 이당쇄연장에 지나지 않는다. 그래서 더욱 저중합도의 올리고당을 기질로 한 GlcNAc6의 효율적 합성법을 소개한다.

[원리] 리조치움을 이용하여 키틴올리고당의 최소단위인 GlcNAc2를 기질로 해서 고농도 유안첨가에 의해 당전이 반응을 행하면 GlcNAc6과 GlcNAc7을 주성분으로 하는 생성물이 침전하게 된다. 이것을 겔여과로 단리한다.

[재료] 효소원으로서 6회 결정을 반복조작한 니와트린란백리조치움(생화학공업)을 이용하였다.

[방법] GlcNAc2 200□을 30% 유안을 함유한 0.1M 초산완충액(pH 4.0) 2□에 용해하고 이용액에 니와트린란백 리조치움 20□을 가해 70℃에서 8시간 반응하였다.

그림-6.5 리조치움 작용에 의한 당전이 생성물의 분석과 겔여과에 의한 분리

(a) 고속액체 크로마토 분석조건

칼럼 : YMC 팩트 칼럼 타입 A-014(SIL)칼럼, 6□.i.d×30□

이동상 : 아세트니트릴-水(70:30), 유속 0.8□/min

검출기 : UV(SPD-^A, 島津제작소)

(b) 겔여과 분리조건

칼럼 : Bio-Gel P-4 칼럼, 2×100□(50℃로 칼럼 보호)

용출액 : 水, 유속 12□/h

검출 : UV검출기

1∼7 : 표준올리고당의 중합도에 대응한 용출위치

투명한 반응액은 반응의 진행에 따라서 서서히 백탁되고 얼마안가서 침전을 생성하였다.

키토올리고당의 물에 대한 용해도가 0.5∼1%로 낮고 양산하는데는 한계가 있다

(4) P-니트로페닐펜타-N-아세틸-키토헵타오시드

현재 리조치움의 활성측정은 Micrococcus luteus의 건조균체를 기질로 하여 그의 용균작용을 이용해서 탁도법으로 행하여 지고 있다. 그러나 이 방법은 기질의 균체의 품질이 일정하지 않다는 것이다. 반응시의 이온강도, pH에 크게 영향을 받는다는 점으로부터 그 활성 측정치의 재현성에 부족하다는 단점이 있다. 이러한 점으로부터 최근 구조가 명확한 리조치움의 활성측정 기질의 개발을 목적으로써 용융법에 의한 발색단으로써 P-니트로페닐기를 도입한 p-니트로페닐펜타-N-아세틸-□-키토펜타오시드(pNP-GlcNAc5)가 화학합성되어 기질로서의 유용성이 시사되고 있다. 여기에서는 효소에 의한 PNP-GlcNAc5의 간단하고 효율적인 합성법을 소개한다.

[원리] 유안첨가에 의해 촉진된 리조치움의 당전이 반응을 이용하여 GlcNAc5를 공여체기질 p-니트로페닐-□-N-아세틸글루코사미니드(PNP-GlcNAc)를 수용체 기질로 하여 반응을 하여 침전으로써 생성된 PNP-GlcNAc5를 직접 분리한다

[방법] GlcNAc5 1g을 0.125M 초산완충액(pH6.0) 80□에 PNP-GlcNAc 3.97g을 디메칠설퍼옥사이드(DM50) 120□에 각각 용해하였다. 두 액을 혼합 후 니와트린란백리조치움 33□을 가해 30℃에서 150시간 방치하였다. 이 경우의 GlcNAc5와 PNP-GlcNAc의 몰비는 1:12이고 2.5% 기질농도로써 반응을 하였다. 반응액은 시간이 지나면서 백탁되고 얼마안가서 침전을 생성한다. 반응종료 시점에서 반응액에 아세톤 600□를 가하고 원심분리에 의해 불용부(F-Ⅰ)와 가용부(F-Ⅱ)로 분화하였다. F-Ⅰ침전을 고속액체 크로마토그라피로 분석하면 PNP-GlcNAc5와 PNP-GlcNAc4의 몰비가 약 10:1의 성분비가 되는 화분이었다. 이 소량의 협잡물 PNP-GlcNAc4를 제거하는 목적에서 F-Ⅰ침전을 원심분리에 의해 차례로 메탄올 200□, 50%메탄올 200□로 4회 최후에 메탄올 200□로 세정을 하였다. 이와 같이 세정한 침전을 데시게이터에서 건조하여 F-Ⅰ a로서 0.25g을 얻었다.

F-Ⅰa를 고속액체크로마토그라피로 분석하면 순도 약 97%의 PNP-GlcNAc5이었다. 수율은 공여체기질 GlcNAc5 당 46%라는 고수율이었다. 이렇게 해서 얻은 PNP-GlcNAc5는 리조치움의 활성측정 기질로써 표준품의 것과 감도면에서 조금도 손색이 없었다.

F-Ⅱ용액에 대해서는 활성탄 20g을 교반하면서 가하고 이 서스펜드 용액을 부흐나 갈데기 상에서 여과하고 잔류물을 물 1□로 세정, 그리고 아세톤 1□로 용출하였다. 용출액을 시럽상태가 될 때까지 농축, 메탄올로 결정화하면 수용체 기질(受容□基質) PNP-GlcNAc 1.92g이 회수된다.

[평가] 본 반응은 목적화합물을 직접 생성물로써 석출시켜 크로마토그라피 조작을 거치지 않고 세정 조작만으로 고순도의 표품을 얻을 수 있었다. 게다가 본 법은 PNP-GlcNAc5의 대량조제가 가능하다. 여기에서 반응 부생성물 PNP-GlcNAc4의 생성을 억제하여 PNP-힟NAc5를 특이적이고 효율적으로 합성하기 위해서는 온도를 가능한 한 낮추고 DMSO농도를 될 수록 높이고 더욱이 공여체에 대한 수용체 기질의 몰비를 가능한한 높이는 것이 필요하다. 그림-6.8에 각종 DMSO첨가 농도를 함유한 혼합용매계에서의 당전이 반응효율을 나타내었다. 이 경우의 DMSO첨가는 수용체기질 PNP-GlcNAc의 고농도에서의 반응을 보증할 뿐만 아니라 목적화합물인 PNP-GlcNAc5의 효율적 생산에 상당히 유효한 용매이다.

그림-6.8 리조치움 당전이 반응에 있어서 PNP-GlcNAc5 생성시의 H2O/DMSO 농도의 영향

「방법」에서 서술한 반응조건에 따라 경시적으로 PNP-GlcNAc5의 생성량을 측정하였다. 분석조건은 그림-6.6(a)에 따랐다.

6.2.2 키토산 올리고당

키토산의 효소분해에는 주로 키토사나제가 관여하고 있다. 키토사나제는 각각의 미생물로부터 추출되어 이것을 이용해서 키토산 올리고당의 효소분해가 시도되었다. 이 경우 키토사나제에 의한 분해는 단당의 생성이 거의 없고 키토산 올리고당의 조제에는 유효하다. 이 키토사나제를 이용한 키토산으로 부터의 GlcN2∼GlcN5의 조제법이 井?와 大?에 의해 보고되었다. 여기에서는 坂井등의 방법에 기초한 효소분해에 의한 키토산 올리고당의 조제법을 소개한다.

[원리] 키토산초산염용액을 키토사나제를 이용해 水解후 생성된 키토산 올리고당을 양이온교환크로마토그라피에 의해 중합도별로 분리한다.

[재료] 100% 탈아세틸화 키토산 14g을 물1.3□에 현탁 여기에 초산을 가해서 용해하였다. 이 용액을 pH5.4로 조제하여 키토산초산염 용액으로 하였다. 효소는 Bacillus R-4가 생산하는 키토사나제(케이아이化成)를 사용했다.

[활성측정] 0.5% 키토산을 함유한 0.067M 초산완충액 0.5□에 적당효소액을 가하고 전량을 1□로 하여 40℃ 10분간 반응한다. 반응액을 5분간 증비후 Rondle Morgan법으로 유리의 아미노당을 정량한다. 1U는 1분간에 1□□의 글루코사민에 상당하는 아미노당을 생성하는 효소량으로 한다.

[방법] 상기 조제한 키토산 초산염용액 400□에 Bacillus R-4가 생산하는 키토사나제를 12분가해 40℃에서 48시간 쭉 교반하면서 반응을 하였다. 이 후 반응액을 0.1N-HCl로 pH2.7로 조제 후 농축을 하였다. 이 농축액에 200□의 메탄올을 가하고 생성된 침전을 원심분리에 의해 제거하였다. 이것의 상등부에 아세톤을 가해서 침전을 생성시키고 이것을 원심분리로 모았다. 이 침전을 아세톤 세정 후 감압건조하여 키토산 올리고당 혼합물로써 5.3g을 얻었다. 키토산 올리고당 혼합물 3g을 50□의 물에 용해하고 이 용액을 Dowea 50W×4 칼럼(H+form, 2.2×30□)에 넣었다. 칼럼을 100□의 물로 세정후 흡착부를 0(600□)에서 4.5N-HCl(600□)의 직선농도 구배에 의해 용출하였다. 그림-6.9에  이때의 용출패턴을 나타내었다. 주피크 3화분을 각각 농축, 아세톤 침전한 후 건조하였다. 용출순으로 F-Ⅰ으로부터 GlcN4HCl 0.411g(13.7%, 키토산올리고당 혼합물로 부터의 수율), F-2로부터 GlcN3HCl 0.981g(32.7%), F-3으로부터 GlcN2HCl 0.920g(30.7%)을 얻었다.

[평가] 효소분해에 있어서 사용한 키토산의 탈아세틸화가 충분하지 않으면 분해물 중에 키토산올리고당이 아닌 물질이 생성된다. 더나아가서 올리고당의 효율적인 조제에는 100% 탈아세틸화 키토산이 적절하다.

그림-6.9 이온교환 크로마토에 의한 키토산 올리고당의 분리

칼럼 : Dowex 50W 칼럼, 2.2×30□

용출액 :0∼4.5N염산에 의한 직선농도 구배

검출 : 닌하이드린법

효소법은 종래의 산분해법에 비해 분해물을 크로마토처리 하기전의 키토산올리고당의 수율(키토산에 대해서 분해율 98.9%)은 높고 또한 중합도 2∼4 키토산올리고당을 얻기 위해서는 상당히 효율이 좋은 방법이다.