제 5 장  키틴, 키토산의 분석

키틴·키토산 실험 매뉴얼

(키틴·키토산 연구회 編)

C    C    R    C

제 5 장  키틴, 키토산의 분석

5. 1  키틴·키토산의 化學的 定量法

이상적인 키틴은 N-아세틸글루코사민(GlGlcNAc)잔기를 100%함유하고 키토산은 글루코사민(GlcN) 잔기를 100% 함유한 것이지만 실제는 아미노기가 단백질과 키틴과의 결합에 관여하고 있어서 키틴분자 중에는 아미노기가 존재하며 또한 탈아세틸화반응의 진행이 100%되지 않아서 N-아세틸기가 키토산 분자내에 존재한다. 그래서 키틴·키토산과 함께 GlcNAc잔기와 GlcN잔기의 정량이 필요하게 된다.

아미노기의 검정에는 콜로이드 적정법이 일반적이지만 오차가 크고 올바른 평가를 하는 것이 어렵다. 아질산분해로 GlcN잔기를 키토스(chitose)<2,5-안하이드로-D-만노스>로 변환시켜 MBTH(3-메칠-2-벤조치아졸론·하이드라존)-염화제이철로 발색시키고, 653□에서 흡광도를 측정하여 정량하는 방법도 있다.

또한 아질산 분해하여 GlcN잔기를 질소분이 없는 키토스 잔기로 변환하고 나서 산가수분해해서 생성된 GlcN·HCl염을 아미노산 자동분석기를 이용하여 정량하는 방법도 있지만 아질산 분해의 완결과 잔류 아질산 이온의 제거가 율속단계이다. 한편 HCl-인돌법도 있는데, 분자량이 크면 적용할 수 없고(수용성 저분자 키토산이 좋다.) 더욱이 적용농도범위가 좁다는 것 등 조작상 어려운 점이 많다. 이하에 순서에 따라 조작법을 기재한다.

5. 1. 1  아질산 분해법

키토산 검체용액(0.04g/L의 1%초산 수용액 또는 1M HCl 수용액)1□를 시험관에 취하고 여기에 10%아질산 나트륨 수용액 1□와 5%황산수소칼륨수용액 1□(초산수용액중에서 반응 시킬 경우 황산수소칼륨을 첨가한다.)를 가하고 실온에서 12시간 반응시킨 후 12.5% 설파민산 암모니움 수용액 2□를 가하고 10분간 진탕한다. 이 경우 아질산나트륨 수용액은 직전이 아닌 미리 조제하는 것이 분해반응이 진행되기 쉽다.

5. 1. 2  MBTH법에 의한 GlcN잔기 정량법

전기한 아질산 분해물(5.1.1에서 얻은 검체)에 0.5% 3-메칠-2-벤조치아졸로·하이드라존 수용액을 1□가하고 실온에서 1시간 방치 후 여기에 0.5% 염화제이철 수용액을 1□가하고 30분후 653□에서 흡광도를 측정한다. 검량선은 글루코사민 염산염을 이용해서 똑같은 조작(아질산 분해를 포함해서)을 하여 작성하면 흡광도로부터 직접 아미노기 함량의 정량이 가능하다. 단, GlcNAc 잔기수가 극단적으로 많은 키틴에서는 아질산 분해물이 수용성(각종 발색조작을 포함해서)으로 되기 때문에 적용할 수 없다.

5. 1. 3  HCl-인돌법에 의한 GlcN잔기 정량법

전기한 아질산 분해물(5.1.1에 얻은 검체 조제 30분 후에 1%인돌-에탄올 용액 0.1□를 가하고 비등탕욕 중에서 5분간 반응시킨다. 빙욕 중에서 충분히 냉각 후 에탄올 1□를 가해서 곧바로 492□에서의 흡광도를 측정한다. 검량선은 글루코사민 염산염을 이용해서 아질산 분해부터 시작되는 조작을 하여 작성하는데, 적용농도 범위가 좁고 감도가 높으므로 조작 측정에는 충분히 주의할 필요가 있다. 전항과 똑같이 키틴의 경우는 분해생성물이 물에 불용성이어서 적용할 수 없다.

5. 1. 4  아미노산 자동분석기를 사용한 정량법

GlcN·HCl염이 아미노산 발색제로도 발색하는 것을 이용하는 것으로써 이하에 日立-835형 아미노산 자동분석기를 사용한 예에 대해서 소개한다.

칼럼 : 4□□ ×250□(#2617)

유속 : 0.275□/min

용출액 : 완충액Ⅰ(pH4.3)→완충액Ⅱ(pH4.9)에의 gradient

완충액Ⅰ : 크엔산 나트륨·이수화물................14.71g

NaCl......................................................2.92g

크엔산·수화물..................................10.50g

치오디글리콜.......................................5.00ml

프리치...................................................4.00ml

카프릴산...............................................0.10mol

in 1L of water(pH4.3)

완충액Ⅱ : 크엔산나트륨·이수화물...................26.67g

NaCl.......................................................54.35g

크엔산·수화물....................................6.10g

벤질알콜................................................5.00ml

프리치....................................................4.00ml

카프릴산................................................0,10ml

in 1L of water(pH4.9)

이 조건에서 GlcN·HCl은 칼럼첨가 후 51.4분 전후에 용출하게 된다. 스탠다드로 GlcN·HCl염을 사용해서 분자 흡광계수를 구하는 것이 가능하므로 이 인자를 사용해서 정량한다. 키틴·키토산의 순도를 조사하고 아질산 분해 후 미반응 아질산을 아세톤 등으로 충분히 세정한 후 소정의 염산 가수분해를 하여 아미노산 자동분석기에 첨가하면 GlcNAc 량의 정량에도 사용된다.

5. 1. 5  콜로이드 적정에 의한 탈아세틸화도의 측정

키토산 분말(1.000□ 올패스) 0.500g을 정확히 평량하고(무수물환산) 이것을 5%초산(v/v)에 녹여서 정확히 100g이 되게 한다. 이 키토산 초산 용액 1.000g(1000□)을 200□의 삼각플라스크에 정확하게 취하고 탈이온수 30□를 가하여 충분히 교반 혼합한다. 지시약으로서 0.1% 톨루딘블루용액 2∼3방울을 가하고 N/400 폴리비닐황산칼륨용액[(C2H3OSK)n n=1.500이상]으로 적정한다.

탈아세틸화도는 다음의 식을 사용해서 산출한다.

[eqn: 탈아세틸화도~=~X/161~over {X/161~+~Y/203}~×~100(%)]

X=1/400×1/1000×f×161×V

Y=0.5×1/100-X

V : N/400 폴리비닐황산칼륨용액 적정치(□)

f : N/400 폴리비닐황산칼륨용액의 factor

이의 콜로이드 적정법으로 구한 탈아세틸화도는 현재 가장 일반적인 방법이라고 할 수 있으나 90%이상의 탈아세틸화도에 대해서는 원소분석이나 다른 방법을 가미해서 결정하지 않으면 신뢰도는 낮고 지시약으로서 8-아니리드-1-나프탈렌설퍼네이트를 사용한  키토산-지시약 복합체에 의한 형광을 폴리비닐황산칼륨 적정으로 소거해서 구하는 방법도 있다.

※ : N/400 폴리비닐황산칼륨용액 표정법

(ⅰ) 폴리비닐황산칼륨[(C2H3OSK)n n=1.500이상]을 탈이온수에 용해하여 N/400폴리비닐황산칼      륨수용액을 조제한다.

(ⅱ) 염화세칠피리디늄 [CH3(CH2)15 N(Cl) : CHCH : CHCH : CH·H2O]을 정확히 평량하여       탈이온수에 용해해서 N/200 염화세칠피리디늄수용액을 조제한다.

[표정] 5□의 N/200 염화세칠피리디늄 수용액을 100□ 삼각플라스크에 넣고 30□의 탈이온수를 가하여 마그네틱스티러로 교반하면서 톨루딘블루(0.1% 2∼3방울)를 지시약으로 하여 N/400 폴리비닐황산칼륨 수용액으로 적정한다. 이 적정치로부터 N/400 폴리비닐황산칼륨 수용액의 factor를 구한다.

5. 1. 6  그 외의 방법

그 외의 방법으로서 반스라이크법에 의한 아미노태질소분석법이 있다. 원리는 아질산 이온이 지방족 제1급 아민과 상온에서 반응하여 정량적으로 질소와 알콜을 생성하는 것으로써 이 질소의 용적을 측정하여 아미노기를 정량하는 방법이다.

그림5-1 반스라이크법의 개략도(유기미량분석연구간담회편 「유기미량정량분석」에서 인용)

그러나 정량에는 반스라이크 감압장치를 사용할 필요가 있고 게다가 대량의 수은을 관리해야 하므로 바로 사용할 수는 없지만 이 장치는 균일계 뿐만 아니라 미분말 일 경우 불균일계에서도 상당히 정밀하게 측정된다. 장치의 개략도는 그림 5-1에 나타내었다. 또한 아미노기의 퍼센트함량의 계산식은 다음에 의한다.

[eqn: -NH2(%)~=~{(V-Vo)×0.5720×F}overW ~×100]

여기에서 V : 질소량(□), V0 : 공시험치(□)(Blank치)

0.5720 = NH2/N2 = 16.024/28.016

F : 읽은 때의 온도·기압에 있어서 질소 1□의 질량

W : 시료의 중량(□)

화합물 함유율은 다음과 같이 하여 계산 할 수 있다.

[eqn: 화합물(%)~=~{(V-V0)×F×meq} over W×28.016 ~×~100]

meq : 화합물의 밀리그램 당량

[시약류 리스트]

① 분해시약 :

1% 아질산 나트륨 용액-아질산나트륨(특급시약) 1g을 탈이온수에 녹여서 100□로 한다. 사용시 이 용액의 일부를 취하여 2배로 희석한다.

초산나트륨-초산용액-초산나트륨(특급시약)(CH3COONa·3H2O) 10g을 250□의 탈이온수에 용해하고 여기에 50vol%의 초산수 250□를 가한다.

10%브롬화칼륨-브롬화칼륨(특급시약) 50g을 탈이온수 450□에 용해한다.

② 세정시약 :

브롬산칼륨용액(약0.12M)-브롬산칼륨(특급시약) 5g을 75□의 탈이온수에 녹이고 여기에 50wt% 황산 500□를 가한다.

40% 치오황산나트륨용액-치오황산나트륨(특급시약) 40g을 증류수 60□에 녹인다.

③ 아조토메타용 시약 :

수산화칼륨 농후 용액-탈이온수 950□를 2,000□ 삼각플라스크에 넣어서 빙냉한다. 여기에 1급 수산화칼륨 1□을 수회로 나누어서 가하고 충분히 용해 시킨다. 온도의 상승에 주의한다.(50℃ 이상이 되지 않도록) 전량을 용해한 후 빙수 중에서 20∼25℃가 될 때까지 냉각한다. 비중계로 비중 1.440이 되도록 물을 가해서 조절한다. 細口병에 옮기고 폴리에칠렌 필름을 씌운 고무마개로 밀봉한다. 하룻밤 방치하고 부유물을 충분히 침강시킨 후 투명한 상등부분을 취해서 아조토메타에 넣는다.

5. 1. 7  중금속 함량 및 과망간산 칼륨 환원성물질 정량

시료 5.0g을 정확히 평량하여 백금도가니(또는 磁製도가니)중 600℃에서 3시간 동안 회화시킨다. 실리카겔이 들어있는 데시게이터 중에서 실온까지 냉각하고 평량해서 회분을 산출한다. 이 회분을 50□의 0.1N-HCl에 녹여 넣고 日本藥局方중의 일반시험법19「중금속 시험법」 제2법에 의해서 납환산으로 정량한다. 비교액으로서 납표준액 2□를 가해서 정량하여 표준으로 한다. 과망간산 칼륨 환원성 물질 정량에서는 시료 1g을 50□의 탈이온수에 현탁하고 60℃에서 30분간 추출한 액 10□를 두껑달린 삼각플라스크에 취하고 0.01N과망간산칼륨액 20□ 및 희황산 1.0□를 가해서 30분간 증비한다. 실온까지 냉각 후 요오드화칼륨(KI) 0.1g과 전분 시액 5방울을 가해서 밀봉하고 잘 흔들어 혼합시키고 나서 10분간 방치한다. 0.01N 치오황산나트륨액으로 적정한다. 별도로 Blank로써 탈이온수 10□를 이용하여 동일한 조작을 한다.

5. 1. 8  알칼리 가용분 및 단백질 함량

충분히 건조한 시료 1.0g을 정확히 500□비이커에 넣고, 5%수산화나트륨(W/V)200□를 가해서 95±2℃에서 2.5시간 교반 추출을 한다. 글라스필터(G1)로 여과하고, 충분히 세정 후 105±2℃에서 3시간 건조, 이어서 실리카겔이 들어있는 데시게이터중에서 방냉한다. 냉각 후, 정밀하게 중량을 재고, 수분을 뺀 감량 백분율을 알칼리 가용분으로써 산출한다.

단백질 함량은 Lowry법으로 측정한다. 前記 알칼리 가용분 측정과 동일한 방법으로 열수 추출하고, 냉각 후 상등액 1□를 취하고, 여기에 시액 A-5□를 가해, 잘 흔들어서 혼합한다. 실온에서 10분간 정치 후, 시액 B 0.5□를 가하여, 다시 잘 혼합한다. 30분동안 색조를 충분히 전개시키고 나서 240□에서의 자외흡수를 측정한다.

[시액]

□ 시액 A : a액 45□와 b액 5□를 사용직전에 혼합해서 시액 A로 한다.

a액(알칼리성 주석산 용액)-주석산나트륨 50□과 무수탄산나트륨 2g을 0.1N수산화나트륨 수용액에 용해해서 100□로 한다.

b액(0.1%황산동 용액)-황산동 0.15g을 탈이온수에 용해해서 100□로 한다.

□ 시약 B : 1N 호린시약(페놀시약)-텅스텐산나트륨(NaWO4·2H2O)100g, 몰리브덴산나트륨(NaMoO4·2H2O)25g 및 탈이온수 70□를 1.5□의 플라스크에 넣고, 여기에 85%인산(H3PO4) 50□와 농염산 100□를 가하여, 모두 혼합시키고 환류냉각기를 사용하여 10시간 동안 비등시킨다. 냉각 후, 황산리튬(LiSO4·H2O) 150g, 탈이온수 50□와 취소수 2∼3방울 가하고, 냉각기 없이 15분간 煮沸하여(끓여서) 과잉의 브롬을 없앤다. 냉각 후, 1□로 희석하고, 여과해서 뚜껑달린 갈색병에 보존한다. 시약의 색은 황색이면 좋고, 녹색이면 환원 정색물(呈色物)의 생성을 나타내는 것이므로 다시 만든다.

또한, 시판의 호린 시약을 사용해도 좋다.

5. 2  키틴, 키토산의 탈아세틸화도 측정

키틴에는, 전항에 기재했듯이, 단백질과의 결합점으로서 유리아미노기는 당연히 존재하지만, 총량은 10%이하여서, 용해성이 낮다는 것과 함께 입체장해가 커서, 정량은 상당히 어렵다. 5.1.1에 기재한 아질산 분해가 질소방출반응이라는 것을 이용해서,

□ 원소분석에서 질소함량의 저하와 탄소함량의 증대로써 탈아세틸화도를 추정, 또는

□ 키틴 미분말을 반스라이크법으로 질소함량을 측정하는 것, 등이 고려된다.

점선부분의 화학반응은

로서 질소가 1분자의 GlcN 잔기당 1분자가 생성되므로, 이 질소용량을 재든지 또는 Chitose 잔기에 질소분이 없다는 점을 이용해서 질소함량의 감소로부터 아미노기 함량을 정량하는 방법이다. 아질산 분해 생성물의 대부분이 물에 불용성이라는 점을 고려하면 ①의 원소분석 또는 킬달 질소분석법이 정도(精度)의 면에서도 좋을 것이다. 한편 키토산의 탈아세틸화도 측정법에 대해서는 몇가지의 방법이 제안되고 있지만 발색단을 아미노기에 결합시켜서 비색분석하는 방법은 입체장해등이 있어서 좋은 결과가 얻어지지 않는다. 더욱이 현재로써는 일반적 분석법으로써 저탈아세틸화도(약 50∼70% 탈아세틸화)의 경우는 콜로이드 적정법(5.1.5를 참조)을, 고탈아세틸화도의 경우는 적외흡수 스펙트럼법(IR법)이 적당하다.

IR법에서도 키토산 분말을 브롬화칼륨분말과 함께 형성하는 펠렛트법과 키토산박막을 직접측정하는 필름법으로 나눌 수가 있다. 펠렛트법이 일반적인데 키토산분말과 브롬화칼륨분말을 균일하게 혼합 형성하는 것이 상당히 어렵다. 이점, 필름법은 필름 조제에 시간이 걸린다는 것과 필름의 두께를 콘트롤할 필요가 있지만 측정이 간편하고 측정 精度를 기대할 수 있어 어느 정도 우수하다고 할 수 있다.

5. 2. 1 적외흡수 스펙트럼법(IR법)에 의한 탈아세틸화도 정량

이 방법은 주로 Roberts등의 보고에 기초한 것으로써 브롬화칼륨 분말과 함께 키토산분말을 더욱 잘게 부수어서 펠렛트로 성형하여 적외흡수 스펙트럼의 1,655□-1의 아마이드Ⅰ 밴드와 3,450□-1의 수산기 신축진동에 의한 밴드와의 흡수비로부터 탈아세틸화도를 계산하는 방법이다. 미리 브롬화칼륨 및 키토산을 충분히 건조할 필요가 있고 양자를 마노(석영, 단백석, 옥수의 혼합물)유체에 취하여 충분히 혼합 분쇄하는 것이 측정精度를 올리기 위한 필요조건이다.

한편, 키토산을 4% 초산수(v/v)에 용해 후, 0.5∼1.0□를 슬라이드글라스 위에 적하하고 유리봉으로 될 수 있는 한 얇게 펴서 페트리 접시를 씌우고 10∼30분간 정치하여 탈포(脫泡)시킨다. 이어서 에탄올-가성알칼리 중에서 고화 시키는 필름법도 한가지 방법이라 할 수 있다. 이 경우 키토산 농도는 점도에 따라 적당히 조절하고 유동성이 있고 얇은 필름이 되는 농도로 할 필요가 있다. 탈포가 끝난 키토산 도포 슬라이드글라스를 메탄올과 약 4M-NaOH 수용액(10:1, v/v)이 들어있는 접시 중에 담그고, 약 1시간 고화시킨다.

그림 5-2a 키토산의 IR 스펙트럼

베이스라인은 A1655 와 A3450을 결정하기 위한

선이다(Roberts의 논문에서 이용).

그림 5-2b 키토산 올리고머의 IR 스펙트럼    표5-1의 IR 탈아세틸화도는 이 그림으로부터

산출

고화한 키토산을 가볍게 수세한 후 메탄올 중에 침적하여 충분히 알칼리를 씻는다. 이 조작중 컷터나이프 칼 또는 면도칼을 사용해서 키토산 필름을 슬라이드 글라스로부터 탈리시키고 메탄올로 충분히 세정한다. 이 필름을 여지에 끼우고 가벼운 압력 하에서 충분히 건조한다. 급격한 가열건조를 초기에 행하면 필름이 수축되거나 파손되므로 충분히 주의할 필요가 있다. 이 필름을 펠렛트홀더에 셀로판테이프등으로 고정하고 IR을 측정한다. 이때 적외광로에 있는 필름 면적을 적당히 가감해서 흡수가 최대로 되도록(각 피크가 샤프하게 나오도록) 조절한다.

베이스라인은 그림5-2처럼 되는데 각각 연구해서 精度를 올리도록 노력하기 바란다. 흡수비 A1655/A3450과 탈아세틸화도의 관계는 Roberts의 데이터 그대로 그림5-3에 나타내었지만 측정하는 사람 각각의 검량선을 작성하도록 한다. 비교하기 위해서 5.1.1의 조작에서 80% 탈아세틸화 키토산(DAc-80)을 아질산법으로 분해한 키토산올리고당(분자량17,000∼21,000)에 대해서 IR법(KBr, 펠렛트), MBTH법(5.1.2) 및 HCl-인돌법(5.1.3)을 사용해서 얻은 탈아세틸화도를 표5-1에 나타내었다. 표 중 DA의 기호가 들어있는 시료는 아질산 분해로 얻은 각 올리고당을 농알카리 중에서 열처리하여 더욱 탈아세틸화를 생한 것이다. 각 방법 모두 일장일단이 있으며 절대적인 방법은 아직 확정되어 있지 않다. 이와 달리 C13무수초산으로 키토산을 N-아세틸화하여 분말자체의 고체 NMR법으로 C13의 케미칼 쉬프트에 의한 측정도 가능하지만 일반적이진 않으므로 생략한다.

그림5-3 IR법으로부터 산출한 N-아세틸기함량과 화학분석 등으로부터 얻은 N-아세틸기함량의 관계(Roberts의 논문에서 인용)

표-5.1 키토산올리고머의 탈아세틸화도 정량법

Sample	IR(Roberts)	HCl-인돌법	MBTH법
DAc-OL-0.3-5 #1	0.50	0.48	0.58
#2	0.58	0.61	0.67
#3	0.57	0.62	0.69
#1-DA	0.64	0.46	0.82
#-2DA	0.57	0.71	0.81
#-3DA	0.62	0.39	0.61
DAc-OL-0.3-12#1	0.41	0.51	0.63
#2	0.50	0.60	0.68
#3	0.52	0.51	0.57
#4	0.47	0.28	0.41
#1-DA	0.62	0.58	0.68
#2-DA	0..63	0.63	0.79
#3-DA	0.53	0.56	0.57
#4-DA	0.64	0.61	0.62

DA : 표기번호의 올리고머를 수산화나트륨중에서 다시 탈아세틸화시킨 시료

5. 2. 2  적외흡수 스펙트럼법에 의한 카르복시 메칠화도의 측정

이 방법은 카르복시메칠화도(CM화도) 50∼80%의 경우에 적용할 수 있다. 전항과 같은 KBr 펠렛트법과 필름법이 적용된다.

(1) KBr 펠렛트법

시료 1g을 100□ 비이커에 취하고 탈이온수 50□에 침적 또는 용해시킨다. 여기에 다시 염산을 가해 pH1.0으로 한다. 30분∼1시간 교반후 아세톤을 가하여 침전시킨다. 침전을 물-아세톤 혼합액(약1:20,v/v)으로 잘 씻어서 탈염을 행한다. 최후에 아세톤으로 씻어서 풍건 다시 70℃에서 3시간 정도 건조시키고 나서 분말 KBr과 혼합해서 펠렛트를 제작한다.

염산처리는

R-CH3COO-Na+ + HCl -□ R-CHCOOH + NaCl

의 반응으로 염이 없는 카본산을 형성시키기 위함이다. 적외흡수 스펙트럼으로부터 그림-5.4에 나타낸 것처럼 베이스라인을 그리고 1655□-1(아마이드Ⅰ밴드) 및 1735□-1(C=O 밴드)의 투과율 A의 차이를 각각 구하여 그 비율 A1735/A1655를 계산한다. 그림-5.5의 검량선으로부터 CM화도를 구한다.

그림-5. 4  카르복시메칠 키틴의 IR 스펙트럼   그림-5. 5  IR법에 의한 CM화도 산출을 위한

(西村(니시무라)등의 논문에서 인용)             검량선

(2) 필름법

水가용성 CM-키틴에 적용하는것으로써 시료를 적당량의 물에 용해하고 가제 4매를 포개어 여과하고 나서 슬라이드 글라스 위에 될 수있는 한 얇게 편다. 페트리 접시를 씌워서 30분정도 정치 탈포시키고 아세톤중에 옮겨서 고화시킨다. 10∼20분간 정치후 메탄올-2N-HCl 혼합액(20:1,v/v)중에 옮기고 30분정도 정치시킨다. 컷터나이프 칼이나 면도칼로 필름을 슬라이드그라스로부터 유리시키고 염산 혼입 메탄올중에 침적하여 발포가 일어나지 않는 것을 확인한 뒤 메탄올 중에 옮겨 잘 씻는다. 최후에 아세톤으로 세정 후 여지에 포개서 1□ 정도의 중량을 주어 풍건시킨다. 70℃에서 10분 정도 건조하고 나서 IR 스펙트럼을 측정하여 前記와 같이 A1735/A1655의 비로부터 CM화도를 산출한다.

5. 3  키틴·키토산의 분자량 측정법

고분자 화합물의 분자량 측정법으로서는 점도법, 초원심분리법, 광산란법, 침투압법, 고속액체크로마토그래피(HPLC), 겔여과법, 겔전기영동법 및 말단기정량법등이 있다. 그러나 키토산 분자량 측정에서 일반적인 것은 점도법이다.

이 방법은 정상유동을 하는 물질의 한 점에 있어서 쉬어응력(sheering stress) □와 쉬어속도(sheer raate) D를 측정하여 그 비로부터 점도(viscosity) □를 구하고 이 □치로부터 분자량을 측정하는 것이다.

물, 알콜등 수많은 저분자 액체나 식염수 등의 저분자 액체에 있어서는 점도는 온도에 의해서 결정되는 그 물질 특유의 定數이다.(뉴튼액체<Newtonean liquid>의 유동<Newtonean flow>). 그러나 키토산과 같은 고분자 물질의 유동은 용액상태에서 많은 경우 뉴튼의 법칙에 따르지 않는다. 이러한 물질에서는 점도가 일정치를 갖지 않고 쉬어응력(또는 쉬어속도)에 의해서 다른 수치를 나타낸다..(비뉴튼<non-Newtonean flow>) 그래서 물질의 유동특성을 표식한 점도곡선을 □와D를 추정해서 구할 필요가 있다. 이를 위해서 이용되는 장치를 점도계(viscometer)라고 한다.

뉴튼 액체의 경우 □가 □나 D에 관계없이 일정하므로 원점을 통과하는 직선이 된다.(고분자 물질을 녹이는 □용매□가 여기에 해당된다.) 비뉴튼 액체의 경우 □와 D의 관계는 직선이 되지 않으므로(양자는 비례관계가 아님) 될 수 있는 한 넓은 범위로 □(또는 D)를 변화시켜서 측정하지 않으면 안된다. 이를 위해 각종 점도계가 고안되었다.

평행이동형 점도계, 회전형 점도계 및 압축형 점도계로 크게 구별되며 평행이동형 점도계에는 평판형, 구형, 원통형, 모세관형 및 원추형의 다섯 가지의 점도계가 있고 구형에서는 落球식 점도계가 있다.

낙구식 점도계의 경우 무한정 넓은 점도□의 뉴튼액체중을 일전속도 U로 쭉 이동하는 반경 R의 球를 고려한다. 이 구가 받는 저항은 스톡스법칙을 받는다.

F=6□R□U

자연낙하의 경우 F는 구에 움직이는 중력과 부력의 차이와 같다. 구와 유체의 밀도를 각각 □0, □로 하면 낙하시간의 평균치를 구하여 다음 식에 대입해서 점도를 계산 할 수 있다.

[eqn: □~=~{d^2 (□_0 -□)gt}over18□~{1-2.104 ~d over D ~+2.09~}](d/D)2

여기에서 □ : 점도(Poise 포이즈)

d : 금속구의 직경(□)

g : 중력가속도(□/sec)

t : 표선 사이의 낙하시간(s)

□: 표선 사이의 거리(□)

D : 원관의 직경(□)

이 경우 낙하시간을 잰 표선은 액면으로부터의 효과를 무시할 수 있을 정도로 액면으로부터 상당히 아래에 위치해야 할 필요가 있다. 한편, 관벽의 영향에 대한 보정은 d/D<0.2이면 상기의 식에 충분하다고 생각된다. 시료의 밀도는 피크노메타등을 이용해서 측정한다. 만약 원관이나 구의 구조, 길이가 결정되면 전기의 식중 d2g/18□{1-2.104d/D+2.09(d/D)3}항은 사용한 낙구점도계(그림5-6)에 대해서 일정치가 되므로 다음과 같이 간략화 할 수 있다.

[eqn: □~=~K(□_0 -□)t]

그림-5. 6  落球式 점도계의 개략도

(川田裕郞 著[점도]코로나社에서 인용)

여기에서 미리 점도표준액을 이용해서 실험적으로 정수 K를 구하면 일정거리의 낙하시간과 시료의 밀도를 측정하는 것만으로 점도를 구할 수 있다. 비교측정법의 경우 원관이나 금속구의 직경을 측정할 필요는 없지만 d/D가 충분히 작다는 것을 확인할 필요가 있다. 구는 볼베어링

그림-5. 7  모세관식 점도계(川田裕郞著 「점도」코로나社에서 인용)

의 구이면 충분하지만 표선 설정위치를 액면으로부터 상당히 아래에 셑트 할 것과 항온성과 온도의 측정에는 충분히 유의할 필요가 있다. 모세관형 점도계는 하겐-포이즐러의 법칙에 기초를 두고 있다. 즉, 모세관을 통해서 흐르는 유체의 유량은 반경의 4승 및 모세관의 입구와 출구의 압력차(P)에 비례하고 유체의 점도(□) 및 관의 길이(□)에 반비례  한다. 어떤 시간(t)에 모세관을 통과하는 유체의 체적을 V로 하면

[eqn: V over t = {□r^4 P} over 8□□]

[eqn: ∴□~=~{□r^4 P}over8□□ ~=~{□r^4 P}over8□q] q : 유량

이 되므로 모세관의 지름 입구와 출구의 압력 차 및 유량을 측정함으로써 유체의 점도가 구해진다.

모세관형 점도계에는 그림-5.7에 나타내었듯이 많은 종류의 점도계가 있다. 그러나 실험실적으로는 Bingham형 과 이의 개량형인 Ostwald형 및 Ubbelode형이 일반적이다.

shear rate를 변화시키면 和田형 점도계이다. 이중에서도 시료의 액량에 관계없이 상당히 연속적으로 측정하는 우베로데(Ubbelode)형이 사용하기 쉽다. 그림의 관 1, 2, 3을 각각 고무관으로 결합하고 측정시에 관로의 입구를 열고 2로부터 빨아올려서 모든관을 개방하여 모세관 통과시간을 측정한다. 희석의 경우 관1로부터 희석액을 가해서 관2를 열고 관3으로부터 공기를 넣고 잘 교반한다.

5. 3. 1  다른 방법에 의한 점도 측정

우베로데형 점도계를 사용해서 키토산의 분자량을 추정하는 조작에 대해서 기재한다. 키토산을 잘 건조하고나서 0.4g을 정확히 재서 취하고 0.2M초산-0.1M염화나트륨-4M요소수용액에 용해하여 10□로 한다.(0.4% 키토산용액, w/v) 다음에 이 0.4% 키토산 용액을 상기의 초산-염화나트륨-요소용액으로 1/2로 희석한다. 같은 조작을 키토산 농도가 최초의 1/64가 될 때까지 반복해서 7종류의 용액을 제작하고 냉암소에 10일간 정치한다(평형화). 우베로데 점도계를 넣은 항온조의 온도를 25℃로 설정하고 각 용액의 점도를 측정한다. 점도식은 櫻田-Howink의 식

[□]=K·Ma

[□]=절대점도(극한점도, 고유점도)

K : 정수 M :: 분자량

□ : 정수(폴리머의 종류, 용매의 종류에 의해 결정한다.)

위의 식에서 양근의 상용대수를 취하면

logM=1/□(log[□]-logK)

Lee에 의하면 탈아세틸화도 약91%의 키토산은 0.2M 초산 - 0.1M NaCl-4M요소용액 중에서 정수K와 □는 각각 8.93×10-4과 0.71이다. 이들의 수치를 사용해서 분자량을 산출한 예를 기재하였다.(표-5.2) 우선 각종의 키토산 농도의 용액에 대해서 모세관 투과시간을 측정하여 점도를 산출한다.

표-5.2 키토산의 점도·상대점도·비점도

농 도(C) (g/mol)희석	점 도	상대점도 □rel	비점도 □sp	□sp/C	1/C ln (□rel)
0.4%(1/1)	26.9	25.1	24.1	60.2	8.06
0.2%(1/2)	7.62	7.12	6.12	30.6	9.81
0.1%(1/4)	3.34	3.12	2.12	21.2	11.4
0.05%(1/8)	1.86	1.74	0.738	14.8	11
0.025%(1/16)	1.43	1.34	0.336	13.5	11
0.0125%(1/32)	1.23	1.15	0.150	12.0	11.2
0.00625%(1/64)	1.15	1.07	0.0748	12.0	11.5
0.00060%(용매)	1.07	-	-	-	-

표-5.2에 있어서 상대점도는 키토산 용액과 용매의 점도비(□/□0)이며, 비점도는 (□/□0)/□0이다. 표 중의 □sp/C 또는 1/Cln(□nel)과 키토산 농도의 관계를 플롯트 하면, 그림-5.8과 같이 되며 키토산 농도 0에 외삽하면 극한점도[□]가 11(□/g)로 된다.

[eqn: [□]~=~ lim from { C ->O }~□_sp /C~=~ lim from { C ->0 }1overC ~ln](□rel)

C : 키토산 농도

그래서 키토산의 분자량은 다음식

logM = 1/□(log[□]-logK)

의 □=0.71, [□]=11, K=8.93×10-4이므로

logM = 1/0.71{log11-(log8.93-4log10)}=5.76

∴M=105.76= 575,000≒580,000

으로 산출된다.

한편 회전점도계는 공장 등에서는 취급도 간단하므로 비교적 잘 사용되고 있다. 이것은 원통 또는 원판 등을 유체 중에서 회전시키고 이것을 정지시키면 그 주변의 유체에 동심원상의 회전흐름을 생성시킬 경우 그 물체는 점도저항에 의해 토크를 받는다. 이 때 회전속도 등이 동일조건일 경우 그 토크는 유체의 점도에 의해 변화되어 점도가 높으면 크게 되므로 이것으로부터 유체의 점도를 구하는 것이 가능하다. 현재 널리 이용되고 있는 것은 원통을 이용한 방법이지만 外관의 크기에 영향을 받지 않는 브룩필더형 회전점도계(B형 회전점도계)가 일반적이다. 다음에 측정 예에 대해서 기재한다.

그림-5. 8  모세관식 점도계에 의한 절대점도 산출법(우베로데형)

표-5. 3  키토산 점도와 농도의 관계

키토산 농도 (g/100□)	점도(cps) (5% 초산수)	점도(cps) (5% 포름산수)
1.0	7,200(No. 3)	6,900(No. 3)
0.5	1,500(No. 2)	840(No. 2)
0.1	55(No. 1)	28(No. 1)
0.05	21(8L)	10(8L)
0.03	11(8L)	5.2(8L)
0.01	2.4(8L)	1.8(8L)

( )안은 사용 아답터 명

표-5. 4  키토산 점도와 분자량의 관계

점도(농도) (g/□)	분자량(×10-4)	아미노기함량(%)*
7(0.70)	2.0	8.10
5(0.70)	1.2	7.95∼7.16
9(0.40)	3.1	8.14
10(0.35)	3.7	8.17
12(0.07)	4.2	8.18
390(0.018)	17.6	8.20
150(0.018)	13.0	8.15
970(0.007)	23.9	8.19
430(0.007)	18.2	8.18
1,300(0.005)	25.5	8.16
890(0.005)	23.5	8.14

* : 콜로이드 적정으로 산출

시료의 키토산은 통상 10%정도의 수분을 함유하므로 미리 건조중량을 측정 할 필요가 있다. 건조중량을 10%라고 하면 0.5%(w/v)용액을 조제하기 위해서 1.6667g(무수물로서 1.5g)을 재서 취하고 300□의 용매(5% 희초산 또는 5% 희포름산)에 가하고 일정한 교반속도(가령60rpm)로 3시간 교반하여 용해시킨것에 대해서 점도를 측정한다. 그 결과의 예를 표-5.3에 나타내었다. 또한 일본수산의 특허에 기재되어있는 점도와 분자량에 대해서 얻은 수치를 표-5.4에 종합하여 기재하였다.

5. 3. 2  점도법에 의한 키틴 분자량 측정

키틴의 분자량은 유니치카(일본의 키토산 회사)의 평가법에 다른다. 그것에 의하면 1,000□ 올패스(all pass) 키틴 분말 시료 3g을 미리 95±2℃로 조절한 50% 수산화나트륨용액(w/w) 100□에 현탁하고 온도를 유지하면서 정확히 2.5시간 탈아세틸화반응 시킨다. 반응종료 후 실온까지 온도를 내리고 여과후 증류수로 충분히 세정해서 알칼리를 씻어내고 건조하여 점도측정용 시료로 한다. 점도측정은 키토산의 분자량 측정에 준 한다.

5. 3. 3  카르복시메칠 키틴의 분자량 측정

고치환 카르복시메칠 키틴의 분자량산출의 점도식이 櫻田등에 의해 제안되었다. 기본적으로는 櫻田-Howink의 식인데 침투압측정으로부터 K=7.92×10-5, □=1.00이 계산되어져 나왔고 수평균분자량(Mn)을 극한점도에 의해 산출할 수 있게 되어 있다.

[□] = 7.92×10-5Mn1.00

또는

log[□] = -4.10+1.00×logMn ([□]in 100□/g)

그림-5.9에 logMn과 log[□]의 관계를 나타내었다. 점도의 측정은 5.3.1에서 행한 키토산 용액의 점도측정법에 준 하는데 0.1N-NaCl 수용액 100□에 1g의 카르복시메칠 키틴을 용해하고 감압여과 등으로 충분히 불순물 등을 제거하고 나서 점도를 30±0.01℃항온조 중에서 측정한다.

그림-5. 9  카르복시메칠 키틴의 극한점도와 수평균분자량의 관계

(30±0.01℃, 우베로데형 점도계)

5. 4  키틴·키토산의 물리화학적 해석

키틴·키토산을 물리화학적 방법으로 해석할 경우 분말이나 재생 키틴, 키토산과 같은 고체를 사용할 경우와 용액상태의 키틴·키토산을 사용할 경우가 있다. 키틴은 용해성이 낮으므로 대부분의 경우 분말로 측정하는 것이 많다. 그러나 키토산은 유기산과 염을 형성하여 용해되므로 분말상·용액상 쌍방의 측정을 할 수가 있다. 단, NMR(핵자기공명법)에 의한 탄소 또는 수소의 각 상태를 용액상 또는 분말상으로 측정할 수 있다. 한편, 키틴·키토산의 분말 또는 섬유상 고체(화이브릴)의 간단한 X선 해석사진으로부터 結晶의 面間融을 계산할 수 있다.

5. 4. 1  핵자기공명법(NMR)

Nuclear Magnetic Resonance(NMR 또는 n.m.r.)은 비교적 역사가 다른 분자분광학이지만 최근 여러분야에서의 유용한 연구수단이 되고있는 방법이다. 특히 수소원자핵(프로톤)의 NMR(Proton Magnetic Resonance : PMR 또는 `H-NMR)은 천연존재비가 100%가까이 높고 흡수강도가 다른 핵보다 매우 강하다는 점 스핀수가 1/2로 흡수선이 샤프하다는 점 및 수소원자는 유기화합물의 구성원소로써 탄소와 함께 제일 일반적이어서 현재까지 가장 잘 연구에 이용되고 있다. 13C은 천연존재비가 낮다는 것과 감도에 난점이 있지만 `H-NMR 다음으로 유용한 측정대상으로서 기기의 진보와 함께 주목받고 있는 분야이다.

(1) 시료조제법

일반적으로 고분자시료의 NMR은 용액상태에서 측정하지만 시료와 용매의 신호의 겹침을 피해야 하므로 `H-NMR에서는 용매로서 중수소화물이 많이 이용된다. 시료농도는 통상 10wt%인데, 13C-NMR과 같은 화학 쉬프트의 영역이 넓은 核種에서는 더욱 고농도에서도 좋다. 그러나 키틴과 같이 용해성이 낮은 시료에서는 저 농도 고체시료 그 자체를 측정할 필요가 있다.

저 농도의 경우 측정온도를 높여서 분자운동성을 향상시키면 감도나 스펙트럼의 분리능을 좋게 할 수가 있다. 고체(분말 도는 필름 상)시료의 경우는 Cross-Polarization-Magic Angle Spinning(13C-CP-MAS)NMR법을 응용해서 측정 할 수 있다. 키틴 및 키틴 유도체의 `H-NMR(13C-NMR도 포함한)측정의 경우 키틴 분말을 감압 하 40℃에서 충분히 건조 후 중수소화 포름산(DCOOD)에 현탁(2∼1.5%, w/v)하고, 실온에서 1시간 정치하여 포름산을 충분히 침투시키고 -20℃에서 동결시킨다. 충분히 동결 한 후 실온에서 해동한다. 이 조작을 반복하면 점조한 키틴-포름산 용액이 조제된다.

화학 쉬프트는 액중에 생성하는 HDO를 표준으로 해서 측정 할 수 있으므로 특별한 표준시약(TMS와 같은 표준)을 가하지 않아도 측정은 가능하다. 한편, 키토산의 경우는 유기산과의 염이 수용성이므로 D2O를 용매로 해서 측정 할 수 있다. 카르복시메칠 키틴이나 하이드록시프로필키틴과 같은 수용성 유도체의 경우도 D2O중에서 측정할 수 있지만 농도가 낮으므로(고점도의 경우), 충전관(5□□<`H-NMR>에서 약0.5□, 10□□<13C-NMR>에서 약2□)중에서 D2O용액을 반복하여 동결건조를 하면(D2O용해와 동결건조를 반복한다.) 스펙트럼의 분리가 좋게된다. 일반적으로는 미량시료(약0.2□)에서도 측정 할 수 있지만 키틴·키토산의 경우 고점도이어서 시료농도를 높일 수가 없으므로 감도를 기대 할 수 없다. 그러므로 측정온도를 키틴-포름산용액의 경우 45℃까지 올릴 필요가 있다.

(2) 측정조건

`H-NMR로 n-butyl-Chitin-DCOOD용액을 측정 할 경우(400MHz JEOL FX-400형)에 대해서 기재하면 폴리머-농도1.8%(w/v), 측정온도 45℃, 스펙트럼 폭6,000□, 펄스 각 90°(10□), 4회 반복측정

그림-5. 10  n-부틸키틴DCOOD 용액의 `H-NMR 스펙트럼

그림-5. 11  키틴(b,c)과 에칠키틴(a)의 13C-NMR 스펙트럼(DCOOD중 45℃)

그림-5. 12  카르복시메칠키틴(a)과 디하이드록시메칠키틴(b)의 13C-NMR 스펙트럼

(D2O중, 45℃에서 측정)

또한 13C-NMR(JEOL FX-60Q<15M□>)로 Chitin과 Ethyl-chitin-DCOOD용액에 대해서 측정한 예를 나타내면 폴리머-농도1.8%(w/v), 측정온도 45℃, 스펙트럼 폭 3,002□, 펄스 각 90°(10□), 21,600회 반복하여 측정.

한편, 薺藤등이 보고한 키토산염의 13C-CP-MAS-NMR의 일례를 나타내면 (Bruker CXP-300-CP-MAS 악세사리), 펄스 각 90°(10□), 500∼2,000회 반복해서 측정(벤젠 용액을 기준으로 해서 측정)

그림-5. 13  키틴 및 키토산의 13C-CP-MAS-NMR 스펙트럼 및 각각의 화학 쉬프트

그림-5.13에서도 밝혀졌듯이 각 원소의 상태가 상당히 명확하게 나타났다. 특히, 화학수식의 경우는 용해성도 상승하므로 치환위치 및 치환도의 검토가 가능하게 된다. 그러나, CP-MAS-NMR에서는 시료관(캅셀)을 2∼4K□의 고속으로 원滑을 회전시키기 위해서 시료의 균일 충진 또한 誘電率이 높은 경우에는 高電力 데캇플에 의한 발열을 완화하게 하기 위해 알루미나 또는 NaCl에 의한 시료의 희석이 필요하게 된다.

CP의 접촉시간은 분자의 운동성에 의해 달라지지만 13C-NMR에서는 보통 1∼10□로 설정한다. 매직 각은 시료 또는 `H의 신호를 관측하면서 조절한다. CP의 접촉시간이 적당하지 않으면 신호의 S/N비가 저하되고 매직각의 조절이 부족하면 선폭이 넓어지는 경향을 나타낸다. CP-MAS법은 고체시료의 구조해석이나 구조-활성 상관의 연구에 유용하지만 반면, 시료조제법에 의해 스펙트럼이 크게 변한다는 것을 예상 할 수 있다. 그러므로 신중한 시료조제가 요구된다.

5. 4. 2  광각 X선 산란에 의한 결정해석(結晶解析)

X선 해석법은 분자의 구조를 정확히 알아낼 수 있는 우수한 방법인데

1. 결정성 시료가 필요하다.

2. 결정화의 조건을 설정하기 위해 많은 시간과 다량의 재료를 소비한다.

3. 기술적 훈련(수학적 훈련도 포함)이 필요하다.

등 각종 조건을 만족시켜서 초기에 가능하게 되는 방법이라고 할 수 있다. 또한, 糖質은 다양한 結晶形(水和, 互變異性, 配座의 다양성에 기인한다.)을 가지며 특히 무코(muco)다당류는 결정형이 복잡하여 구조연구가 어렵다. 그러나 섬유화가 가능하면 분자 配向에 의한 X선 산란의 규칙성을 도출시킨다.(원자가 3차원적 주기를 가지며 배열하는 격자가 X선에 대해서 회절격자로 되어 X선 간섭상을 생성한다.) 이 규칙적인 X선 간섭상으로부터 원래의 격자를 형성하고 있는 원자의 위치를 복원하는 작업을 X선 해석이라고 한다.

그림-5.14 트란스-1,4-폴리부타디엔의 X선 강도 s2I곡선

백그라운드 곡선은 헤일로(후광)라 불리는 고분자 특유의 폭넓은 피크, 고분자의 회절상은 결정과 비결정으로부터의 해절상의 중합에 의한 것으로 생각되며 적당한 방법으로 분리가능하면 전체의 면적비로부터 결정화도를 추정할 수 있다. 루란드의 방법이 제일 엄밀하다고 생각된다.

그림-5. 15  □-나선 구조를 가진 섬유의              X선 회절사진과 개념도

(a) □-나선 구조 모델

(b) X선 산란과 층선

(c) X선 회절 사진

이상적 결정에서는 브랏크조건 2dsin□=n□(2□는 산란각, n은 회절의 차수)에서 인정되는 방향자체의 회절이 일어나서 샤프한 회절선이 나타난다. 그러나 다당등의 고분자 結晶에서는 微結晶(분자 配向에서 생긴다.)의 크기나 격자의 흐트러짐 때문에 넓어진 회절선으로 되는 것이 많다. 그림-5.14에 트란스-1,4-폴리부타디엔의 용융성형된 配向시료의 회절상을 예시하였다. 각 회절선의 적분 폭(또는 半値폭)과 반사의 차수의 관계로부터 미결정의 크기와 격자의 흐트러짐을 계산할 수 있다. 한편, 延伸配向시킨 시료(섬유 등)를 이용하면 X선 사진위에는 赤道線上이나 層線上에 회절반점이 나타난다. 이것을 섬유도형이라 한다. 층선간 거리로 연신방향의 격자정수(통상 이것을 C폭이라 한다.)가 구해진다. C폭 방향에서의 길이로부터 결정내에서의 주쇄의 콘포메이션의 개략을 추정 할 수가 있다. 그림-5.15에 □-나선 구조를 가진 섬유의 X선 회절사진을 예시 하였다. 面間폭을 결정하는데 있어서는 먼저 NaCl의 미분말을 표준으로 해서 線源과 필름면간의 거리를 구하고 이것으로부터 면간 폭을 구할 수가 있다. 또한 그림-5.16은 키틴의 X선 회절상의 일례이다.

그림-5. 16  키틴의 X선 회절상의 일례

키틴 : 즈와이 게의 힘줄로 조제

(1)키틴 섬유 조제법

키틴 미분말(120메쉬 패스) 5g을 50□의 99% 포름산에 현탁하고 실온에서 1시간 정도 정치 후 -20℃에서 하룻밤 동결시킨다. 실온에서 해동하는 이 조작을 균일하고 점조한 겔이 얻어질 때까지 계속한다. 포름산과 디클로로초산(DCA)을 가해서 균일한 용액으로 한다.(키틴 농도 3∼5%, w/v, DCA농도 5%) 여기에 방사직전에 아세톤을 10%전후 가해서 잘 반죽시키면 연사성(延□性)의 액이 된다. 플란넬(flannel)등의 여포로 가압여과후, 0.07∼0.1□□×50holes의 백금 노즐로부터 아세톤 중에 가압추출 응고 시킨다.(아세톤 응고 浴長 약80□, 50%에탄올 수<제2응고욕 약 80□>6.0∼7.0m/min의 속도로 방사). 냉수중에서 延伸(1.2∼1.4배) 조작을 하고 카셋트에 감는다. 입상 NaOH를 가한 메탄올 중에 하룻밤 침적하여 포름산이나 DCA를 제거한다. 메탄올 중에서 충분히 세정하고 건조한다. 이때 권려(卷戾)를 하면 필라멘트간의 접착을 상당히 방지할 수 있다.

(2) 키토산 섬유 조제법

분자량 약 4×104의 키토산(탈아세틸화도 70∼80%) 13g을 100□의 4% 초산수에 서서히 용해시킨다(실온). 플란넬등의 여포를 이용해서 가압여과 한 후 0.07∼0.1□□×50holes의 백금 또는 스테인레스 노즐로부터 암모니아액(2M-CuSO4 수용액에 농암모니아수를 가하여 완전히 용해시킨액)중에 추출하여 응고시킨다. (浴長 약80□, 6.0∼7.0m/min의 방사속도), 약 70□의 제2응고욕(50%에탄올수)을 거친 후 온수(약60∼70℃)중에서 연신조작을 하여(1.2∼1.5배) 카셋트에 감는다. 충분히 수세 후 2∼5% EDTA·4Na 수용액중에 담궈서 脫銅조작을 한다. 이 때, 80∼90℃에서 행하면 효과적이다. 중성이 될 때까지 충분히 수세 후 메탄올 중에 침적하여 탈수후 풍건하면 키토산 섬유(약3∼10 denier)가 얻어진다.

小川등은 키토산(탈아세틸화도100%)의 초산수용액으로부터 캐스트법으로 필름을 제작하고 이것을 200℃의 열수처리로 습도의존성이 없는 고결정성의 시료를 얻어서 단위격자 정수 a=8.24Å, b=16.48Å C(섬유축)=10.39Å, 櫻井(a=8.67Å, b<섬유축>=10.24Å, C=8.92Å)등의 보고도 있다. 또한 薺藤 등에 의하면 게껍질 키토산은 (a=8.9Å, b=17.0Å, C<섬유축>=10.25Å인 열처리로 고결정성 키토산으로 이행한다는 점, 새우 키토산은 櫻井등과 같은 결정형을 취하여 열처리해고 고결정형으로 이행되는 양은 많지 않다는 것을 CP-MAS측정의 양면으로써 추정하였다. 이것은 조제법에 의해서 각종 결정형을 취하여 얻은 것을 나타내고 있다. 또한 측정시료 조제에 있어서는 측정 전반에 걸쳐서 사용된 시료(동일조건으로 조제하였다.)를 유의 할 필요가 있다. 한편, 키틴 섬유의 경우 결정도가 시간과 함께 변화(수소결합의 재생 등에 의해)하므로 키틴 유도체의 구조해석과 함께 충분히 유의할 필요가 있다.

5. 5  키틴의 점도 측정

분자량(MW)  : 우베로데(Uberode) 점도법

점       도  : B형 점도계

약       품  : 1) 염화칼슘(CaCl2·2H2O)

2) 메탄올( MeOH)

Method

염화칼슘(CaCl2·2H2O) 100g에 메탄올포화용액 100g을 1:1로 섞은 다음 70∼80℃의 온도에서 3일 동안 끓인다. 이때, 수욕조(water bath) 상태에서 리히비 냉각기를 설치하여 MeOH 증발을 막는다.

단, 1:1로 섞은 조제 약품이 담긴 flask에 눈금을 정해놓고 증발된 만큼의 량은 MeOH로 채운다.

수욕조 상에서 3일 동안 반응 후 잔존 물질을 여과하여 사용한다.

위의 실험 과정에서 정제된 시약(용액)을 가지고 1g, 2g, ....□g필요량의 chitin을 녹인다음(이때 용해 시간은 3day 정도 소요됨) 이 용액을 우베로데 점도법으로 측정한다.

cf : chitin의 Mesh는 60Mesh이상 고운 것이어야 한다.

[□]=K×MW□     K=1.07×10-1, □=0.40

이때, MW : 분자량,  K : 상수,  [□] : 점도

키틴은 산 이외의 용매에 용해되지 않으므로 분자량을 점도법으로 직접 측정하는 것이 곤란하다. 그래서, 어떠한 조건으로 탈아세틸화사여 키토산으로 하고 이것의 분자량을 상술의 점도법으로 결정하여 키틴으로 환산한다고 하는 여러 가지 유니티카의 평가법이 일반적이었다. 그것에 의하면, 1000□ 올패스 키틴 미분말 시료 3g을 미리 95±2℃로 조절한 50% 수산화나트륨 용액(W/W) 100ml에 현탁하고 온도를 유지하면서 정확히 2.5시간 탈아세틸화 반응시킨다. 반응 종료후, 실온까지 온도를 내리고 나서 여과후 증류수로 충분히 세정하여 알칼리를 씻어내고 건조하여 점도측종용 시료로 한다. 점도측정은 키토산의 분자량 측정에 준 한다.

그러나, 최근, 키틴이 염화칼슘이수염을 포화시킨 메탄올 중에서 교반하면 용해된다는 것이 발견되어, 이 용액중에서의 점도와 분자량의 관계식이 제출되었다.

먼저, 7종류의 분자량 旣知의 키토산을 아세틸화하여 분자량 旣知의 7종류의 재생 키틴으로 하고, 이것을 염화칼슘이수염을 포화한 메탄올 중 실온에서 교반 시킴으로써 완전히 용해 시킨다. 다음으로, 이것들의 점도를 회전점도계로 측정하고, □sp/c 나 ln□rel/c 와 점도와의 관계에 의해 고유점도 [□]를 구한다. 3가지의 측정 예를 그림에 나타내었다.

또한, 이와 같이 하여 구한 7종류 모두의 키틴 고유점도를 키토산의 데이터와 함께 표 8.6에 나타내었다. 표에 나태낸 키틴에 대해서의 분자량과 [□]의 관계를 그림 8.18에 나타내었는데, 이것에 의해

[□]=2.54×10-2M0.45

의 점도식이 유도되었다. 더욱이, 염화칼슘이수염 포화 메탄올 중에 분자량 미지의 키틴을 녹이고, 회전점도계를 사용하여 [□]를 구하면 분자량을 직접 구할 수 있다.

상술한 염화칼슘이수염 포화 메탄올 중에서의 키틴의 [□]와 분자량의 관계식을 구할 때 까지의 순서를 정리하여 그림에 나타내었다.

표 8. 6  각종 키토산 및 키틴의 고유점도

키 토 산	키토산의 단리원	키 토 산		키 틴
		[□]1	MW×10-3	[□]2	MW*×10-3
A B C D E F G	홍게, 껍질 홍게, 껍질 게 껍질*1 홍게, 껍질 홍게, 껍질 새우 껍질 게 껍질*2	0.66 1.65 2.40 3.32 6.10 14.10 16.51	11 40 68 107 251 819 1022	1.79 2.84

5. 6   CM-키틴의 CM화도 측정

0.8135% CM-CHITIN 용액 0.5g

↓

0.5% CHITOSAN(DA 87%) 용액 1g 혼합

↓

증류수 30□ 첨가

↓

TOLUIDIN BLUE 용액 2∼3방울을 적하

↓

N/400-PVSK 용액으로 적정

(용액이 파란색에서 보라색으로 변색될 때까지)

CM화도 = [eqn: [87-((X/161)/(X/161+Y/203))×100]×2]

X = V ×0.998 ×161 ×1/400 ×1/1000

Y = 5 ×10-3-X

V = N/400-PVSK 소비량