제 2 장 키토산과 部分脫아세틸 키틴의 調製

2. 1  키틴으로부터의 키토산의 調製法

[원리] 키틴은 40%정도의 고농도 알칼리 수용액 中 또는 용융알칼리 중에서 가열함으로써 N-아세틸기의 탈리가 일어나 키토산이 된다.

[재료] 분말키틴 - 갑각류 큐티클을 前章의 방법(제1장 1.1절 1a-2a-3)으로 정제 후, 분쇄하여 42메쉬의 체를 통과한 것을 사용한다.

[시약] 40%수산화나트륨 용액 - 특급 시약의 입상 수산화나트륨 240g을 이온교환수 360g에 용해한다.

10% 초산

95% 에탄올

[조제방법] 분말키틴 8.30g 및 40% 수산화나트륨 수용액 500g을 500□의 4구플라스크에 넣고, 油浴중에서 가열하여 6시간 환류한다. 이때, 질소가스를 0.8□/min의 속도로 흡입시키면서 모터로 교반을 계속한다.

6시간 후에 냉각하고 글라스 필터(G3)를 이용해서 조 키토산을 모으고 세척액이 중성이 될 때까지 충분히 세정한다. 조 키토산을 10%초산에 용해하고 하룻밤 실온에서 방치한 후, 40%수산화나트륨 용액을 적하한다. 생성된 침전은 원심분리(10,000×g, 30분간)로 모으고, 이온교환수 약 500□에 현탁한다. 현탁액이 중성을 나타낼 때까지, 원심분리와 재현탁의 조작을 반복한다. 얻어진 침전은 95%에탄올로 세정하고, 실온에서 진공건조 한다.

이상의 조작에 의해, 콜로이드 적정에 의한 탈아세틸화도 96%의 키토산 489g이 얻어졌다. 분말키틴으로 부터의 수율은 59%이다.

[고찰] 키틴의 열 알칼리 용액 중에서의 탈아세틸은, 반응시간 보다 오히려 알칼리 용액의 농도에 의존한다. Kurita등은 키틴을 20%, 30% 및 40%수산화나트륨 용액 중, 환류하에서 1시간 가열함으로써 탈아세틸화도가 32%, 43% 및 88%가 되었다고 보고하였다. 또한, 고도로 탈아세틸화된 키토산을 얻는 방법으로서, 분말 키틴을 용융 수산화칼륨중, 180℃로 30분간 가열하는 방법이 제창되었다.

2. 2  접합균 균체로부터 키토산의 단리법

[원리] 사상균 중에서 접합균류(Zygomycota)에 속하는 균주의 세포벽에는 키틴과 함께 비교적 다량의 키토산이 함유되어 있다. 배양으로 얻은 균체를 약알칼리로 처리 후, 초산으로 처리하여 키토산을 얻을 수 있다.

[균주 및 배지] 균주 - Absidia butleri HUT-1001을 이용한다.

포테토덱스트로스 배지 - 포테토덱스트로스 한천 배지(榮硏化學)39g 및 효모엑기스 3g을 이온교환수 1,000□에 가열 용해한다. 용기에 분주 후, 고압 증기 멸균(121℃, 15분간)한다.

키토산 생산 배지 - 글루코스 20g 및 효모엑기스 1g을 수도수 500□에 용해하고 pH를 4.5로 조정한 용액과, 펩톤 10g, 황산암모늄 5g, 인산수소이칼륨 1g, 염화나트륨 1g, 황산마그네슘칠수화물 0.5g 및 염화칼슘이수화물 0.1g을 수도수 500□에 용해하고 pH를 4.5로 조정한 용액을 각각 고압 증기 멸균한다(121℃,  15분간). 멸균 후 이들을 무균적으로 혼합한다.

[시약] 초산완충액 - 0.1M초산 및 0.1M초산나트륨 수용액을 혼합해서 pH4.5로 한 후, 고압 증기 멸균(121℃, 15분간)한다.

2% 수산화나트륨 용액

20% 수산화나트륨 용액

2% 초산

[제조방법] 배양 - 포테토덱스트로스 배지 8□를 시험관(1.8∏×18cm)에 분주하고, 고압 증기 멸균 후, 斜面으로 한다. 여기에 보존 배양으로 백금鉤를 이용하여 균사를 접종하고 24℃에서 5∼7일간 배양하여 포자를 착생시킨다. 포자가 충분히 착생된 사면배양에 멸균한 초산완충액 10□를 가하고 시험관 믹서로 진탕하여 포자 현탁액을 제작한다. 포자의 농도는 Thoma의 계산반을 이용하여 측정한다. 키토산 생산 배지 200□를 함유한 500□ 삼각 플라스크에 농도가 약 5×104spores/□가 되도록 포자 현탁액을 접종하고, 24℃에서 4∼7일간, 회전 진탕 배양(진폭 5cm, 회전수 500rpm)한다.

키토산의 추출 - 배양 후, 균사체를 글라스필터(G3)로 모으고, 이온교환수로 충분히 세정한다. 세정균체를 2%수산화나트륨 수용액 50□와 함께 폴리프로필렌제 삼각플라스크에 넣고, 오토클레이브 중에서 115℃, 1시간 가열한다. 처리 후, 불용물을 글라스 필터로 모으고, 이온교환수로 세척 액이 중성이 될 때까지 세정한다.  이 알칼리 불용물에 2%초산 100□를 가하고 30℃, 30분간 마그네틱스틸러로 교반한 후, 원심분리(15,000×g, 30분)로, 상등액과 침전으로 분별한다. 침전은 다시 2%초산 100□를 가하고 동 조건으로 교반과 원심분리를 한다. 2회분의 상등액을 글라스 필터(G3)로 흡인 여과하고 여액을 20%수산화나트륨 용액으로 pH 8.5로 한다. 여기에서 생성된 침전을 원심분리(10,000×g, 10분간)로 모으고, 이온교환수 100□에의 현탁과 원심분리(10,000×g, 10분간)로 2회 반복하여 세정하고 실온에서 진공 건조한다. Ab. butleri HUT-1001을 이용할 경우, 배양액 1□로부터 약 1.0g의 키토산이 얻어졌다.

[고찰] 키토산 생산균으로서, 종종 Mucor rouxii가 이용되지만, 고바야시(小林) 등에 의하면, Mucor보다도 Absidia에 속하는 균주의 경우가 대체로 키토산 收量이 많고, 시험한 125균주 중에서는 Ab. butleri HUT-1001이 최고의 收量을 나타내었다. 키토산의 수량은, 배양 4일째 까지는 급증 하지만 그후의 증가는 완만하며, 7일째에 최대로 도달된 후에는 완만하게 저하한다. 또한, 키토산의 분자량도 배양 시간과 함께 저하되는 경향이 보여졌다.

사상균 由來 및 갑각류 유래의 키토산을 비교하면, 적외흡수스펙토르의 형상은 양자 모두 거의 동일 하지만, 전자의 분자량은 약간 낮다. 또한, 금속흡착 등의 성질에 차이가 인지되었다. 이러한 성질의 차이가 양자의 구조 또는 조성의 어떠한 차이에서 유래하는가는 금후, 검토하지 않으면 안될 문제일 것이다.

2. 3  콜로이드상 키토산의 조제법

[원리] 키토산은 희산에 용해 후, 중화하면 겔상태가 된다. 이 겔을 기계적으로 분산시켜서 미립자상의 콜로이드상 키토산을 얻는다.

[재료] 분말 키토산 - 2.1절의 방법으로 갑각류 키틴으로부터 조제한 키토산을 분쇄하여 42메쉬의 체를 통과한 것을 이용한다.

[시약] 0.5N염산, 0.5N수산화나트륨 용액

[방법] 분말 키토산 10g을 이온교환수 1,000□에 현탁한 후, 0.5N염산 100□를 가하고 실온에서 30분간 교반하여 용해시킨다. 불용부분은 글라스 필터(G2)로 제거한다. 여액은 와링브렌더로 10,000rpm, 5분간 처리한다. 처리후 pH를 약 9가 될 때까지 이 용액에 0.5N수산화나트륨 용액을 적하한다. 석출된 침전을 원심분리(10,000×g, 10분간)로 모으고 이온교환수 약 500□에 현탁한다. 현탁액이 중성이 될 때까지 원심분리와 현탁의 조작을 반복하고 침전을 세정한다.

중성이 현탁액 500□를 와링브렌더로 10,000rpm, 5분간 처리하여 미립자상의 균일한 콜로이드상 키토산으로 한다. 콜로이드상 키토산의 농도는, 일정 용량을 정평한 페트리접시에 취하고, 실온에서 진공 건조하여 그 건조 중량에 의해 산출한다. 분말 키토산으로부터의 수율은 약 80%이다.

[고찰] 조제한 콜로이드상 키토산은 폴리용기에 넣고 5℃의 냉암소에 보관하면 2주간 정도 보존 할 수 있다. 콜로이드상 키틴(제1장 1.2절)과

똑같이, 건조시키지 않고 현탁액의 상태로 사용한다.

2. 4  수용성(부분 탈아세틸) 키틴의 조제

2. 4. 1 키틴의 부분 탈아세틸에 의한 방법

[원리] 키틴은 실온에서 농알칼리 수용액에 용해하여 고점도의 알칼리 키틴 수용액으로 한다. 이것을 실온에서 장시간 방치하면 랜덤한 탈아세틸이 진행된다. 이 방법으로 조제된 표품은 불균일계에서 탈아세틸화 한 것과 달리, 탈아세틸화도가 45∼55%인 경우는 수용성을 나타낸다. 이 표품은 보통□수용성 키틴□이라고 부른다.

[재료] 분말키틴 - 갑각류 큐티클을 화학적 방법으로 조제한 키틴(제1장 1.1절 1a-2a-3)을 와링브렌더로 분쇄하여 200메쉬의 체를 통과한 것을 사용한다.

[시약] 40%수산화나트륨 용액 - 특급의 입상 수산화나트륨 30g을 이온교환수 45g에 용해하여 실온까지 냉각한다.

아세톤 - 0℃로 냉각 할 것.

함수아세톤 - 아세톤 7용량에 대해

이온교환수 1용량을 가해, 0℃로 냉각

할 것.

질산은 용액 - 질산은 1.0g을 이온

교환수 100□에 용해하여 갈색의 적하

병에 보존한다.

[방법] 분말키틴 3.0g 및 40%수산화나        그림 - 2. 1  알칼리키틴 조제의 장치도

트륨 용액 75g을 500□광구병에 넣고           A:유리관   B:실리콘 마개   C:광구병

25℃의 항온수조에 놓은 후 아스피레           D:항온수조   E:온도계

이터로 감압(약 30mmHg)을 유지하면           F:마그네틱스틸러

서 마그네틱스틸러로 3시간 교반한다(

그림-2.1). 3시간 후, 용기를 빼내어 잘게 부순 얼음 225g을 가해, 커다란 유리봉으로 용액이 물엿 상태가 될 때까지 충분히 반죽 혼합한다. 용기를 25℃의 수조로 옮기고 상압에서 마그네틱스틸러로 교반을 77시간 더 한다.

77시간 후, 용기를 빙욕중으로 옮기고 반응액을 5℃이하로 유지하면서, 염산을 소량씩 적하하여 반응 액의 pH를 약 9로 한 후 0.1N염산으로 8.7로 한다. 그리고, 0℃로 냉각한 함수아세톤 5□중에 반응 액을 적하한다. 이때, 반응액의 7배량의 냉아세톤을 준비하여, 반응액의 적하와 병행해서 이 냉아세톤을 가해 액 전체의 아세톤과 물의 비율을 항상 7:1로 유지한다.

적하 종료 후, 용액을 30분간 정치하고, 면 상태의 침전을 모아 상등액을 경사법 등으로 될 수 있는 한 제거한다. 침전을 글라스 필터(g3)로 모으고, 세액에 질산은 용액을 적하해도 탁함이 생기지 않을 때까지 함수아세톤으로 세정한다. 최후에 아세톤으로 세정하고 동결 건조한다.

중화 이후의 조작은 될 수있는 한 5℃이하의 온도에서 행한다. 이 방법으로, 탈아세틸화도 50%의 수용성 키틴 2.28g(수율 76%)이 얻어졌다.

[고찰] 수용성 키틴을 물에 녹이기 위해서는, 잘게 부순 얼음에 수용성 키틴을 약 1%의 농도가 되도록 가하고 교반하면서 용해시킨다.

원료 키틴의 성상 및 건조 상태에 의해서는 상술한 방법으로 조제해도 수용성 키틴이 얻어지지 않는 것도 있다. 콜로이드 적정에 의한 탈아세틸화도가 45∼55%의 범위에 있지 않은 경우는, 상술의 탈아세틸화 반응시간을 적당히 연장 또는 단축하여 다시 조제할 필요가 있다. 또한, 탈아세틸화도가 상술한 범위에 있지 않아 용해되지 않을 때에는, 0.5%초산에 0.5%농도가 되도록 용해하여 수산화나트륨으로 중화하면 용액 상태가 된다.

2. 4. 2  키토산의 부분 아세틸화에 의한 방법

[원리] 최근, Kurita등은 키토산을 부분 아세틸화에 의한 수용성 키틴의 조제법을 보고하였다.

키토산을 고도로 팽윤시킨 상태로 아세틸화하여 유리 아미노기의 약 50%에 랜덤하게 아세틸기를 도입함으로써 수용성을 발현시켰다.

[재료 및 시약] 키토산, 무수초산, 수산화칼륨

[실험방법 및 결과] 키토산(탈아세틸화도 0.90)0.3g을 10% 희초산 8□에 용해하고, 8□의 메탄올로 희석한다. 피리딘 100□와 무수초산 1.1g(유리 아미노기에 대해서 6배 몰량)을 혼합시키고, 실온에서 교반하면서 키토산 용액을 가한다. 고도로 팽윤된 혼합물을 5시간 교반한 후, 300□의 아세톤에 넣고 침전을 여과하여, 아세톤으로 세정한 후에 건조한다. 수산기에의 아세틸화도 약간 일어나므로, 생성물을 100□의 0.1M수산화칼륨의 메탄올 용액에 현탁하고 실온에서 6시간 처리하여 에스테르 결합을 선택적으로 절단할 수 있다. 수량 0.28, 적외흡수스펙토르법으로 구한 아세틸화도 0.49.

생성된 부분아세틸화 키토산에 5% 희초산을 가하였을 때 93wt%가 용해되었다. 불용분을 여과하여 제거하고, 여액의 pH를 12로 조정한 후, 300□의 아세톤-수(7:1) 혼합액에 주입하면 목적으로 하는 수용성 유도체가 얻어진다. 이 샘플은 종래법으로 조제한 수용성 키틴(2.4.1을 참조)과 같은 용해성을 나타낸다.

[평가 및 고찰] 수용성을 발현하기 위해서는 유리 아미노기의 약 50%를 랜덤하게 아세틸화 하는 것이 필순이다. 이를 위해서, 될 수 있는 한 고도로 팽윤된 상태에서 반응을 할 필요가 있다. 일부 불용분이 남는 것은, 원료의 키토산에 남아 있는 아세틸기가  블럭상태로 분포하고 있기 때문이다.

반응시에 피리딘의 량을 10□로 하면 팽윤의 상태가 다소 악화된다. 게다가 치환반응의 랜덤성이 저하된 결과, 불용분이 약간 증가한다. 또한, 키토산 용액을 먼저 피리딘 용액에 넣어 팽윤 겔로 한 후에, 무수초산을 가해도, 부분 아세틸화는 가능하지만, 생성물의 수불용분의 부분이 다소 많아진다. 반응조건의 미세한 차이가 생성물의 용해성에 크게 영향을 주는 것이 특징이다.

종래법에 있어서 특히 번잡한 것은, 중화에 의해 생성된 염화나트륨을 제거하는 공정이지만, 그 점 이 방법은 간편하여 다량으로 조제할 경우에도 적당하다.

여기에 나타낸 키토산의 고팽윤 상태를 이용함으로써, 다른 아실화 시약(아세칠콜로라이드, 노나노일클로라이드, □-부칠로락톤)을 이용해도 완화한 조건하에서 아실화를 효율적으로 진행시킬 수가 있다.