제1장  키틴의 調製法

1. 1 게껍질·새우껍질로 부터 키틴의 단리法

[원리] 게껍질이나 새우 껍질 등의 갑각류의 외골격(큐티클)에는, 키틴 외에 탄산칼슘 등의 무기염류, 단백질, 지질, 색소 등이 함유되어 있다. 일반적으로, 키틴은 이들 공존 물질을 以下의 3단계를 거쳐 제거함으로써 단리 된다.

① 탈회(무기염의 제거) - 희염산(1a)또는 에칠렌디아민사초산(EDTA) 용액(1b)중에 침적한다.

② 탈단백 - 수산화나트륨 수용액 중에서 가열한다(2a). 또는, 단백질 분해균(또는 프로테아제)을 작용시킨다(2b).

③ 지질 및 색소의 제거 - 유기 용매로 처리한다.

키틴의 단리는, 목적에 따라서 以上의 처리를 적절하게 조합해서 하면 좋다.

표-1. 1  차새우껍질에서 단리한 각종 키틴의 성상 비교

단리방법*1	단백질*2(%)	회분(%)	탈아세틸화도*3(%)	분자량*4
1a - 2a - 3 1b - 2a - 3 1a - 2b - 3 1b - 2b - 3	0.0 0.0 0.9 0.3	0.1 0.3 0.9 0.5	17.1 12.4 10.6 9.9	1.8×106 2.6×106 3.1×106 3.5×106

*1 : 번호는 본문 참조. *2 : 瀧口 등의 방법에 의함. *3 : Sannan 등의 방법에 의함.

*4 : 5%염화리튬을 함유한 N,N-디메칠아세트아마이드 용매에 시료를 용해하고, 그것의 극한점도에 의해 산출하였다. 단, 키틴의 점도식은 보고되어 있지 않으므로, 키토산에 관한 Lee의 정수를 代用 하였다.

무기염 및 단백질을 거의 완전하게 제거하기 위해서는, 1a-2a-3의 처리가 적당하지만 조건이 과도하여 키틴 자체에 중합도의 저하, 탈아세틸 등의 변성을 어느 정도 유발한다. 한편, 1b-2b-3의 처리는 온화하여 변성이 작은 키틴을 얻을 수 있지만, 탈회 및 탈단백이 불완전하게 된다(표-1.1).

여전히, 처리는 보통 1-2-3의 순서로 하지만, 2-1-3의 순서로 하는 경우도 있다.

[재료] 통상, 새우나 게의 큐티클이 이용된다. 유영 아목(遊泳亞目:대부분의 게類)의 큐티클은 유수 중에서 세정 후, 해머로 5mm크기 정도로 분쇄한다. 건조한 큐티클은 실온에서 5∼6개월 보존 가능하다. 먼바다 보리새우(오끼아미)는 육질을 단리 하는 것이 어려우므로 취급이 어렵다. 재료로서는 차새우의 복절(腹節)이 비교적 취급하기 쉽다. 2b를 하기 위해서는 처리 도중에 한 번도 건조시키지 않는 것이 탈단백율이 높다.

(1) 탈회방법

a. 염산에 의한 方法

[시약] 2N 염산

[방법] 갑각류 큐티클 20g(건조중량)을 2N염산 1,000□중에, 실온에서 2日간 침적한다. 반응 초기는 기포가 많이 발생되므로, 유리 봉으로 때때로(가끔씩) 교반하고, 위로 떠오른 큐티클을 침전시키도록 한다. 도중에 1회, 새로운 염산으로 교환한다. 2일간 침적 후, 이온교환수로 세척 액이 중성이 될 때까지 충분히 세정한다. 차새우의 큐티클을 이용할 경우, 수율은 약 50%이다.

b. EDTA에 의한 방법

[시약] EDTA용액-특급 시약의 에칠렌디아민사초산이나트륨수화물을 이온교환수에 용해해서 0.1M용액으로 하고, 25% 암모니아수로 pH를 7.5로 한다.

[방법] 갑각류 큐티클 20g(건조중량)을 EDTA용액 1,000□중에, 실온에서 6일간 침적한다. 2일째에 새로운 EDTA용액과 교환한다. 6일 후, 큐티클을 모으고, 이온교환수로 충분히 세정한다. 차새우의 큐티클을 이용할 경우, 수율은 약 50%이다.

(2) 탈단백 방법

a.. 수산화나트륨에 의한 방법

[시약] 1N수산화나트륨 용액

[방법] 탈회한 큐티클 20g(건조중량) 및 1N 수산화나트륨 용액 1,000□를 스텐레스제 용기에 넣고, 가끔씩 교반하면서 36시간 증비한다. 도중에 가끔씩, 액면의 높이가 거의 일정하게 될 때까지 이온교환수를 가하여 증발한 수분을 보충한다. 증비 개시로부터 6시간째에 새로운 수산화나트륨용액으로 교환한다. 36시간 후, 불용물(粗 키틴 조각)을 모으고, 세척 액이 중성이 될 때까지 이온교환수로 충분히 세정한다. 차새우의 탈회 큐티클을 이용했을 경우, 수율은 거의 60%이었다.

b. 단밸질 분해균에 의한 방법.

[균주 및 배지] 균주 - Pseudomonas maltophilia LC-102를 사용한다.

영양 한천 배지 - 엘릿히肉엑기스 10g, 펩톤 10g, 염화나트륨 2g 및 한천 20g을 수도수 1,000□에 가열 용해하고, pH를 7.0으로 조정한다.

탈회큐티클 배지 - 인산수소이칼륨 2g을 수도수 1,000□에 용해하고, pH를 7.0으로 조정한 후, 1,000□당 8g(건조중량)의 탈회 큐티클을 가한다. 탈회큐티클은 탈회 처리 후 건조시키지 않은 상태로 사용하는 것이 바람직하다.

이들의 배지는 분주 후, 121℃, 15분간 고압 증기 멸균을 한다.

[방법] 배양 - 영양 한천 배지 8□를 함유한 시험관(1.8×18cm)을 斜面으로 하고, Ps. maltophilia LC-102株의 보존 배양으로 1백금이의 균체를 접종한다. 이것을 30℃, 18시간 정치 배양한다. 다음으로, 탈회큐티클 배지 80□를 함유한 50□판구플라스크에, 사면 배양으로부터 균체를 1백금이 접종하고, 30℃에서 왕복 진탕 배양을 행한다. 일정 시간 배양 후, 플라스크를 121℃, 15분간 고압 증기 멸균하고, 粗키틴 조각을 모아서 이온교환수로 충분히 세정한다. 차새우 탈회 큐티클로부터의 수율은 거의 60%이다. 차새우 탈회 큐티클의 경우, 24시간 이내에 단백질 함유율은 약1%이하로 저하된다. 그 후에도, 약간의 탈단백은 인지되지만, 장기간 배양해도 단백질의 완전한 제거는 달성되지 않는다(그림-1.1). 아직, Ps. maltophilia LC-102는 유영 아목 이외의 갑각류 큐티클의 탈단백에는 적절하지 않다.

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30□□                [갑각류큐티클시료(탈회방법)]□

□                 ○ : 차새우복절부(1b)       □

□□                ● : 차새우복절부(1a)       □

□                 △ : 무당게 껍질(1a)        □

단    20□□                ▲ : 왕새우복절부(1a)       □

백      □                                             □

질      □□                                            □

(%)      □                                             □

10□□                                            □

□                                             □

□□                                            □

□                                             □

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0        1       2                4       8

배양 시간(day)

그림-1.1  Pseudomonas maltophilia LC-102에 의한 각종

갑각류 탈회 큐티클의 탈단백의 경시 변화

(3) 지질 및 색소의 제거

[시약] 95% 에탄올

[방법] 탈회 및 탈단백 처리를 한 조 키틴 조각 20g을 환저플라스크에 넣고, 95%에탄올 500□를 가하여 가열하고, 6시간 환류한다. 냉각 후, 키틴조각을 모아 에탄올로 세정한 후, 풍건한다. 조키틴으로 부터의 수율은 95%이상이다. 분말 키틴을 만들기 위해서는 와링브렌다로 10,000rpm에서 5분간 분쇄하여 목적으로 하는 입도의 체를 통하게 한다.

[고찰] 차새우의 큐티클을 재료로 하여 상기 두 가지의 탈회 방법과 두 가지의 탈단백 방법을 조합시켜 제조한 4종류의 키틴 표품의 성상을 표-1.1에 나타내었다. 염산에 의한 탈회 및 수산화나트륨에 의한 탈단백의 조합(1a-2a-3)으로 조제한 표품은, 단백질 및 회분을 거의 함유하지 않지만, 탈아세틸 및 解중합도가 진행되었다. 한편, EDTA 및 단백질 분해균의 조합(1b-2b-3)으로 조제한 표품은, 탈아세틸 및 解중합의 정도는 낮고, 단백질 및 회분의 함량이 높았다. Ps. maltophilia LC-102에 의한 탈단백은, 차새우를 포함하는 유영 아목의 큐티클에서는 단백질 함유율이 1%이하까지 저하되었으나, 유영 아목 이외의 무당게, 왕새우 등의 큐티클에서는 장기간 배양해도 3∼8%의 단백질이 잔존하였다(그림-1.1).

효소 프로테아제에 의한 탈단백의 방법은 문헌을 참조하기 바란다. 효소의 종류, 큐티클의 종류, 처리 조건 등에 의해서 잔존 단백질 량은 달라지지만, 어떻게 해도 완전한 탈단백은 달성되지 않는다. 더욱이, 시판의 단백질 분해효소에는 키틴 분해 활성을 가진 것도 있으므로 주의를 요한다.

1. 2  콜로이드狀 키틴의 調製法

[원리] 콜로이드상 키틴은, 키틴을 염산 또는 황산에 용해 후, 다량의 물을 가하여 키틴을 미립자 상으로 석출 시킨 것으로서, 현탁액의 상태로 사용한다.

[재료] 분말 키틴 - 키틴은 갑각류 큐티클을 前節의 1a-2a-3의 방법으로 조제 후, 분쇄하여, 42메쉬의 체를 통과한 것을 사용한다.

[시약] 염산 - 특급 시약, 35%

[방법] 염산 800□를 5℃이하로 냉각하고, 교반 하면서 분말 키틴 20g을 소량씩 가한다. 키틴이 균일하게 분산된 후, 서서히 가온하여 37℃로 하고, 30분간 그 온도로 유지한다. 키틴이 용해됨에 따라서, 현탁액의 탁도가 감소하고, 점도가 증가한다. 30분 후, 미용해의 키틴을 그라스울을 깐 깔데기를 이용해서 재빨리 흡인 여과한다. 2∼3분 이내에 용액은 백탁된다. 30분간 교반한 후, 5℃에서 하룻밤 방치한다. 상등 액의 대부분을 경사 법으로 제거한 후, 여지(동양여지, No.2)로 흡인 여과하여 키틴을 모으고, 이온교환수 약 500□에 현탁한다. 현탁액의 pH가 5 이상이 될 때까지, 여과와 재 현탁을 반복한다.

콜로이드상 키틴 현탁액의 농도는, 일정 용량을 청평 페트리 접시에 취하고, 실온에서 진공건조 하여, 건조 중량에 의해 산출한다. 분말 키틴으로부터의 수율은 약 70%이다.

[고찰] 콜로이드상 키틴은 키티나제활성 측정 및 키틴분해균의 키틴源으로서 이용되지만, 스프레드라이 등으로 건조한 것은, 다시 현탁해도 그 분해성이 현저하게 저하되므로, 현탁액 상태로 보존 할 필요가 있다. 콜로이드상 키틴 현탁액은 5℃의 암실 내에서 2주간 정도 보존 가능하다. 사용에 있어서는 충분히 교반한 후 사용한다.

조제에 있어서, 초음파를 이용하여 다량의 키틴을 염산에 용해시키는 방법도 보고되었다.