키틴, 키토산 및 그 올리고머의 생리활성

키틴, 키토산 핸드북 제4장

제 4 장 편집위원  東 市郞

CHITIN/CHITOSAN RESEARCH CENTER

( C    C    R    C )

키틴, 키토산 및 그 올리고머의 생리활성

4. 1  키틴 유도체의 면역활성과 항종양 활성

키틴 및 키틴 유도체는 성형가공이 용이하고, 라이소자임에 의해 가수분해되는 생체 적합성 고분자로써 최근 주목받고 있다. 필자 등은 키틴 유도체를 면역증강제 및 의료용 재료로써 개발하는 것을 목적으로, 각종 키틴 유도체의 면역증강 활성, 항종양활성, 감염 저항성 증강能 및 약물 담체로써의 가능성에 대하여 검토하였다.

4. 1. 1  키틴 유도체의 非특이적 및 특이적 면역 응답 증강能

필자 등의 연구실에서는, 지금까지 세균유래 및 관련의 합성 면역증강제에 대하여 상세하게 면역활성을 검토하여 이들 면역 증강제가 마우스 복강 마크로파지의 종양세포 장해활성을 현저히 증강시키는 것을 발견하고, 유력한 면역증강제 후보 그룹의 한 가지로써 마크로파지 활성화 시험을 행하였다. 필자 등은 戶倉 등과 공동으로 합성 키틴 유도체를 이용하여 마크로파지 활성화 시험을 한 결과, 표 4. 1에 나타내었듯이, 30% 탈아세틸 키틴(DAC-30), 70% 탈아세틸 키틴(DAC-70), 키토산 및 카르복시 메칠(CM)-키틴(치환도 0.8)에서 강한 마크로파지 활성화능이 인정되었다. 이 중에서도 DAC-70의 현저한 마크로파지 활성화능이 인정되어, CM-키틴에 비해 활성화능의 지속성, 저 투여량에서의 효과의 점에서 더 유효하다는 것이 밝혀졌다. DAC-70의 C2번의 아미노기(pka 6.4∼6.8)를 트리메칠화하여 염기성을 강하게 하거나, C2의 아미노기에 펩티드결합으로 아미노산 1분자를 도입한 유도체의 마크로파지 활성화능은 DAC-70과 거의 같았지만, DAC-70의 C2를 CM화, 석시닐화 또는 트리메칠화 함으로써 마크로파지의 활성화능은 현저하게 감소되었다. 이것으로써, DAC-70의 마크로파지 활성화능 발현에는 그것의 염기성이 중요하다는 것이 시사되었다.

마크로파지 활성화 시험에 의해 제일 유력한 면역 증강제로써 선발된 DAC-70은 분자량 약 20만, 고유점도 10.0, 9일간의 가급적인 라이소자임 소화에 의해 8잔기 이하가 90%, 5잔기 이하가 74%인 올리고머로 분해되는 것이 밝혀졌다. DAC-70은 마우스 복강 마크로파지 활성화능 외에도, 몰못트에 있어서 혈 중 항체생산, 지연형 과민증의 유도, 마우스에 있어서 네츄럴 킬러세포 활성화, 헬파 T 세포 및 동종 세포 장해성 T 세포(CTL)에 대한 면역 증강활성(아쥬반트 활성)을 나타내는 것이 밝혀졌다. 그렇지만, DAC-70은 시험관 내에서 마크로파지 및 CTL을 활성화 하지 않고, 마우스 비(脾:비강)세포의 증식을 촉진하지 않는다는 등, 세포 유래 리포다당(LPS) 및 BCG 세포벽 골격과는 다른 기서로 면역증강 활성을 발현하는 것으로 생각된다.

표 4. 1  키틴 유도체의 마크로파지 활성화능

활성화물질	치환기	화합물 명	활성화능
R1 = COCH3	R2 = H	키틴	-
= COCH3 : 0.7 H : 0.3	= H	30%탈아세틸 키틴(DAC-30)	+++
= COCH3 : 0.3 H : 0.7	= H	70%탈아세틸 키틴(DAC-70)	++++
=H	= H	키토산	+++
= COCH3	= COCH3	아세틸 키틴	-
= COCH3	= CH2CH2OH	하이드록시에칠 키틴	+
= COCH3	= CH2CHCH2OH OH	디하이드록시프로필 키틴 (DHP-키틴)	+
= COCH3	= H : 0.75 CH2COOH : 0.25	카르복시메칠 키틴(0.25) CM-키틴(0.25)	-
= COCH3	= H : 0.44 CH2COOH : 0.56	CM-키틴(0.56)
= COCH3	= H : 0.2 CH2COOH : 0.8	CM-키틴(0.8)
= COCH3	= PO3H2	인산화 키틴	-
= COCH3	= SO3H	황산화 키틴	-
피란·코폴리머(양성대조) +++++

4. 1. 2  DAC-70의 사이토카인 유발 활성

DAC-70의 면역 증강 활성 발현의 메커니즘을 밝히기위해, 면역 응답 조절인자(사이토카인) 생산에 대한 DAC-70의 효과를 검토하였다. DAC-70을 마우스 복강 내에 투여하면 6∼12시간 후에 혈청 중의 콜로니 형성 자극인자(CSF) 활성이, 24시간 후에 인터페론(IFN) 활성이 현저하게 상승하였다. 한편, DAC-70은 시험관 내에서 마우스 복강 마크로파지에의한 인터로이킨1(IL-1) 및 CSF 생산을 증강 하였지만, 마우스 脾세포에 의한 CSF, 인터로이킨2(IL-2), IFN, 마크로파지 활성화인자(MAF) 생산, 및 마크로파지에 의한 IFN 생산은 증강하지 않았다. 또한, DAC-70은 종양 괴사 인자 생산系에 있어서 Priming, eliciting 어느 것의 효과도 나타내지 않았다. 이상의 결과에 의해, DAC-70은 마크로파지유래인자(모노카인) 생산 증강을 특징으로 하는 면역증강제 이며, 직접 임파구 유래인자(임포카인) 생산을증강하지 않는 물질로, 모노카인을 중개하여 임포카인에 의한 면역 응답 증강이 유도되는  물질로 추정되었다(그림4. 1).

4. 1. 3  DAC-70의 항 종양 활성 및 숙주의 감염 저항성 증강능

DAC-70은 BALB/c 마우스에 있어서 Meth-A 선유육종(線維肉腫)의 생착을 현저하게 억제하고, strain2 몰못트에 이식한 同系의 line-10 간암의 퇴축(退縮) 및 임파節 전이억제에 대하여 유효성을 나타내었지만, C57 BL/6 Lewis 폐암 전이계 및 FBL-3 백혈병 마우스의 延命에 대해서는 효과를 나타내지 않았다. 한편, DAC-70은 마우스의 대장균 및 先代 바이러스 감염에 대한 숙주의 비특이적 저항성을 현저하게 증강하는 것이 밝혀졌다.

4. 1. 4  키틴 유도체 유래 다공성 입자의 면역활성

IL-1 : 인터로이킨-1   CSF : 콜로니 형성 자극인자    CTL : 세포장해성 T 세포

IL-2 : 인터로이킨-2   IFN : 인터페론

그림 4. 1  DAC-70에 의한 면역 증강 활성 발현의 기서

키틴 유도체의 특징인 생체내 소화성 및 성형가공의 용이성으로부터 각종 의료용 재료에 응용하려고 하는 시도가 행해졌다. 필자 등은 키틴 유도체의 서방성 약물 담체로써의 가능성을 밝히기 위해, 약물의 침투·봉입이 가능한 부분 탈아세틸 키틴(DAC-80)으로 조제한 다공성 입자의 면역 부활을 검토하였다. 입자경이 0.2∼0.7□의 DAC 비드는 그대로 현탁액으로써 마우스의 복강내에 투여해도 복강 마크로파지를 활성화하지 않지만 저농도(0.5∼4%)의 초산으로 전처리 함으로써, 초산의 농도에 따라서 마크로파지의 활성을 증강하였다. 또한, DAC-비드 표면만을 다시 아세틸화하면, 초산처리의 유무에 관계없이 마크로파지 활성화능을 나타내지 않게 된 것으로부터, 입자 표면의 아미노기가 산과 염을 형성하여, 용액 중에서 해리 상태로 있는 것이 활성 발현에 중요하다는 것이 시사되었다. 이러한 것은 시험관 내의 마크로파지에 의한 IL-1 생산의 系에서도 같아, 마크로파지와 접촉하는 입자표면의 성상이 중요하다는 것을 재확인 한 것이었다.

더욱이, 입자경이 작은 다공성 DAC-미크로스피어(2.5□)를 이용하여 마크로파지 활성화 시험을 하였을 때, 초산처리 하지 않은 것에서 DAC-70과 거의  같은 투여량·투여시간에서 활성화능을 나타내는 것이 밝혀졌다. 또한, 모노카인 생산에 대해서도, DAC-미크로스피어는 DAC-70과 동정도의 증강능을 나타내었다. 한편, 같은 입자경의 키틴 유래 미키로스피어는 마크로파지에 의해 탐식되지 않는 비드와, 탐식되는 미크로스피어가 어떠한 기서로 면역 증강 활성을 발현하는지가 금후 더욱 상세한 검토가 필요하다고 생각된다.

4. 1 5  황산화카르복시메칠(SCM) 키틴에 의한 암 전이 억제 효과

암의 전이는 암 세포의 原發菓의 유리와주변 조직에의 침윤으로부터 시작되어 원격 부위(전이菓)에서의 증식에 이르기까지의 복잡한 과정으로 되고, 그 사이 세포 外 매트릭스나 기저막의 중요한 구성성분인 헤파란황산은, 암전이성 메라노머 세포에 의해 생산되는 헤파라나제에 의해 분해된다는 점, 또한 그 효소적 분해는 헤파린에 의해 저해된다는 것이 보고되었다.

헤파린은 결합조직 중의 비만세포로부터 주로 생산되어, 구조상은 불균일한 설폰화 글리코사미노글리칸으로, 구성당으로써 N-아세틸글루코사민과 우론산(글루크론산이나 이즈론산)의 반복된 단위로 되어있다. 그 생물활성은 매우 다양하여, 항응혈작용(안티트롬빈Ⅲ에의 결합에 의한다), 혈관 신생의 촉진, 섬유아세포증식인자(FGF)와의 상호작용, 지연형 과민증의 억제, 세포 증식에 미치는 작용 등이 알려져 있다.

이미, 헤파린 및 그 관련물질을 이용하여 암전이를 저지하도록 하는 시도가 행하여졌다. 螺良(나량) 등은 헤파린이 암세포의 폐전이의 억제에 유효하다는 것, 그 억제 기서로써 응고계 캐스케이드의 활성화를 동반한 혈소판 응집에 의해 형성된 종양 혈전의 저해 일 것이라고 보고하였다. 또한, 入村 등은 항응혈작용이 없는 헤파린 유도체가 메라노머 세포의 헤파리나제 활성을 저해하고 메라노머 세포의 실험적 폐전이를 억제하는 것을 발견하였다.

필자 등은 설폰화 키틴 유도체(키틴헤파리노이드 유도체)의 전이성 암세포에 의한 폐 전이에 미치는 효과를 검토하였다.

마우스 실험 종양계에의한 폐 전이 실험 모델로써는, 그림 4.2에 나타내었듯이 주로 두 가지 방법이 행해진다. 암세포를 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고, 일정기간 후의 폐의 전이 결절수를 계측하는 실험적(인공적) 폐 전이계와, 암세포를 마우스의 발에 피하 이식하고, 原發菓가 일정한 크기에 달했을 때(이미 전이가 시작됐다)에 외과적으로 절제하고, 다시 일정기간 경과한 후에 폐의 전이 결절수를 계측하는 자연 폐 전이계이다.

한편, 이용한 설폰화 키틴 유도체의 화학구조는 그림 4. 3에 나타내었고, 그 분자량 및 분석치(설폰화도나 카르복시메칠화도)는 표 4. 2에 나타내었다. 이들 키틴헤파리노이드 유도체는 헤파린에 비해서 혈소판 응집 저해작용, 항응혈 작용이 매우 강하다는것(헤파린의 1/1,000∼1/10,000 이하), in vitro에 있어서 암세포의 증식에 대한 직접적 효과도 거의 인지되지 않는다는 것이 발견되었다.

그림 4. 2  암 전이 실험 모델

표 4. 2  키틴 헤파리노이드의 분석치

표 품	S(%)*1	-SO3-*2	-COO-*2	분자량(×104)*3
설폰화 키틴 S-키틴 Ⅱ S-키틴 Ⅲ	8.54 10.22	0.73 0.87		1.3 2.4
설폰화 CM-키틴 SCM-키틴Ⅰ SCM-키틴Ⅱ SCM-키틴Ⅲ	1.43 6.70 7.66	0.12 0.57 0.65	0.8 0.4 0.56	1.8 1.0 2.4
설폰화 탈아세틸키틴 S-키틴 S-키토산	IL89 5.90	NHAc*2 1.32(0.30) 0.68(0.30)	0.6 0.6	4.2 4.7
CM-키틴 (O-카르복시메칠키틴)	0	0	0.8	6.3

(주) *1  설폰화도(%)

*2  반응기의 수/N-아세틸글루코사민잔기

*3 평균분자량(헤파린에 의한 점도 방정식으로 계산)

최초에 각종 키틴 유도체를 이용해서 마우스의 실험적 전이계에 미치는 효과를 검토하였다. B16-BL6 메라노머 세포와 함께 각종 설폰화 키틴 유도체를 마우스의 꼬리 정맥 내에 투여하고, 14일 후에 폐 전이 결절수를 계측하였다. 표 4. 3에 나타내었듯이, S-키틴 및 SCM-키틴은 헤파린과 같이 현저한 폐 전이의 억제 효과를 나타내었다. 그러나, 그 탈아세틸화한 유도체인 S-키토산 및 SCM-키토산에서는 충분히 설폰화 되었음에도 불구하고 저지 활성은 인지되지 않았다. 이들 결과로부터 글루코사민 잔기 중의 C6 번의 설폰화 및 C2 번의 N-아세틸화가 실험적 폐 전이계에 있어서 키틴 헤파리노이드의 고차 전이 효과 발현에 중요한 역할을 한다는 것이 시사되었다. 이용한 키틴 유도체 중에서 설폰화도가 높은 SCM-키틴 Ⅲ는 거의 항응혈 작용을 나타내지 않았고, 용량에 의존하여(50∼500□/마우스) 강한 전이 억제활성을 나타내었다. 그러나, 전술했듯이 설폰화되지 않은 CM-키틴에서는 전혀 효과가 인지되지 않았다(표 4. 4).

키틴 CM-키틴 S-키틴 SCM-키틴 S-키토산 SCM-키토산	R1 = COCH3 = COCH3 = COCH3 = COCH3 = COCH3 : 0.3 H,SO3H : 0.7 = COCH3 : 0.3 H,SO3H	R2 = H = H,CH2COOH = H,SO3H = CH2COOH,SO3H = H,SO3H = CH2COOH,SO3H

그림 4. 3  키틴 및 그 유도체(키틴헤파리노이드)의 화학구조

표 4. 3  B16-BL6 세포의 정맥내 주사에의한 실험적 폐 전이에 미치는

키틴헤파리노이드의 효과

정맥내 투여	황산화도*1	투여량 (□/마우스)	폐전이결정수(14일째)	P*2
			평균치±SDC분포범위
실험Ⅰ 대조군(PBS) 헤파린-Na S-키틴Ⅱ S-키틴Ⅲ S-키토산 SCM-키토산	(8.54) (10.22) (11.89) (5.90)	250 250 250 250 250	124±34(92∼165) 8±4(4∼12) 52±7(47∼65) 15±7(7∼24) 103±9(89∼24) 134±23(96∼156)	＠0.001 ＠0.005 ＠0.001
실험Ⅱ 대조군(PBS) S-키틴 Ⅰ S-키틴Ⅱ S-키틴Ⅲ	(1.43) (6.70) (7.66)	250 250 250	62±14(44∼78) 58±18(40∼90) 30±10(20∼42) 8±2(4∼12)	＠0.005 ＠0.001

(주)  C57BL/6마우스(5마리/군)에, B16-BL6세포(5×104)와 함께 키틴

헤파리노이드를 정맥 내에 주사하였다.

*1  설폰화도(%)         *2  student's two-tailed t-test에서 대조군과 비교

다음으로,  강한 활성을 나타낸 SCM-키틴Ⅲ를 이용하여 마우스 자연 폐 전이에 미치는 효과에 대해서 검토하였다. 표 4. 5에 나타내었듯이, 마우스의 발에 B16-BL6 메라노머를 이식 후, 키틴 헤파리노이드를 종양이식 국소에 투여하였다.

표 4. 4  B16-BL6 메라노머 세포의 정맥 내 주사에 의한 실험적

폐 전이에 미치는 SCM-키틴Ⅲ의 효과

정맥 내 투여	투여량 (□/마우스)	폐전이 결정수(14일째)	P*
		평균치±SD(분포범위)
대조군(PBS)		109±16(87∼130)
SCM-키틴		100±12(96∼126)
SCM-키틴	500 250 100 50 10	35±3(29∼42) 44±7(48∼64) 77±3(74∼81) 80±6(74∼87) 95±7(86∼101)	＠0.001 ＠0.001 ＠0.005 ＠0.01

(주) C57BL/6마우스(5마리/군)에, B16-BL6세포(5×104)와 함께 키틴 헤파리노이드를 정맥에 주사하였다. 2주간 후에 마우스를 죽여 폐의 전이 결절수를 측정하였다.

* student's two-tailed t-test에서 대조군과 비교

표 4. 5  B16-BL6세포의 피하 이식에 의한 자연 폐 전이에 미치는 키틴

헤파리노이드의 종양내 투여의 효과

종양내 투여	투여일	투여량 (□/마우스)	원발종양경(21일째)	폐전이결절수(35일째)	P*
			평균치±SD(□)	평균치±SD(분포법위)
대조군(PBS)			9±4	42±13(31∼64)
SCM-키틴	7 7,10 7,10,13	200 200 200	10±3 10±2 9±3	30±8(19∼41) 13±10(1∼25) 5±3(1∼8)	＠0.001 ＠0.001
CM-키틴		200	10±2	30±22(10∼64)
헤파린-Na		200	10±2	18±5(12∼26)	＠0.001

(주) C57BL/6마우스(5마리/군)에 암세포를 이전 후, 상기에 나타낸 키틴 헤파리노이드를 종양이식 국소에 투여하였다. 원발과를 이식 후 21일 째에 외과적으로 절제하고 더욱더 절제 후 2주간 째에 마우스를 죽였다.

* Student's two-tailed t-test에서 대조군과 비교.

다음으로, 강한 활성을 나타낸 SCM-키틴Ⅲ를 이용하여 마우스 자연 폐 전이에 미치는 효과에 대해서 검토하였다. 표4. 5에 나타내었듯이, 마우스의 발에 B16-BL6메라노머를 이식 후 키틴 헤파리노이드를 종양 이식 국소에 투여하였다. 종양 이식 후 21일째에 원발과를 외과적으로 절제 후 더욱 더 14일째에 폐의 전이 결절수를 조사하였다. SCM-키틴Ⅲ를 3일 째에 3회 투여한 경우에 유의한 전이 저지 효과가 인지되었는데 1회 투여에서는 거의 억제 활성을 나타내지 않았다. 본 실험에 있어서, 모든 유도체의 투여에 의해서도 외과적 절제 시의 원발 종양경(크기)에는 차이가 인지되지 않았다. 이것은 in vitro에 있어서 키틴 헤파리노이드가 암세포의 증식이나 생존율에 전혀 영향을 주지 않았던 성적을 고려하면, 전이 억제 효과는 암 세포에 대한 직접적인 작용에 의한 것은 아니라고 생각된다. 또한, SCM-키틴Ⅲ의 정맥 내 투여에 의한 폐 전이의 치료효과에 대해서도 조사하였다.

표 4. 6  B16-BL6 세포의 피하 이식에 의한 자연 폐 전이에 미치는 키틴

헤파리노이드의 치료효과

정맥 내 투여	투여일	투여량 (□/마우스)	폐전이결절수(35일째)	P*
			평균치±SD(분포범위)
실험Ⅰ 대조군(PBS) SCM-키틴Ⅲ S-키틴Ⅱ CM-키틴 헤파린-Na	7,9,11,13,15,17,19	- 200 100 50 200 200 200	62±22(35∼84) 4±3(0∼8) 11±8(4∼22) 36±26(16∼71) 11±8(6∼23) 41±18(25∼72) 19±16(8∼43)	＠0.001 ＠0.005 ＠0.005 ＠0.001
실험Ⅱ 대조군(PBS) SCM-키틴Ⅲ	7,9,11,13,15,17,19 7,9,13,16,19 7,11,15,19	- 200 200 200	43±5(38∼49) 9±8(0∼21) 48±6(41∼54) 41±14(25∼58)	＠0.001

(주) C57BL/6마우스(5마리/군)에 암 세포를 이식 후, 상기에나타낸 기간에 키틴 헤파리노이드를 정맥 내에 투여하였다. 원발과를 이식 후 21일째에 외과적으로 절제하고, 다시 2주 후에 마우스를 죽였다.

* Student's two-tailed t-test에서 대조군과 비교

표 4. 7  B16-BL6세포의 피하이식에 의한 자연 폐 전이에 미치는 키틴

헤파리노이드의 치료효과

정맥 내 투여	투여일	투여량 (□/마우스)	폐전이결절수(35일째)	P*
			평균치±SD(분포범위)
대조군(PBS) SCM-키틴Ⅰ SCM-키틴Ⅱ SCM-키틴Ⅲ S-키틴Ⅱ CM-키틴 SCM-키토산 헤파린-Na	22,24,26,28,30, 32,34	- 200 200 200 200 200 200 200	52±10(39∼65) 62±18(14∼80) 14±7(7∼24) 9±6(1∼17) 14±8(7∼26) 54±22(34∼88) 74±7(68∼83) 74±7(17∼34)	＠0.001 ＠0.001 ＠0.001 ＠0.001

(주) C57BL/6마우스(5마리/군)에 암세포를 이식 후, 상기에 나타낸 기간에 키틴 헤파리노이드를 정맥 내에 투여하였다. 원발과를 이식 후 21일째에 외과적으로 절제하고, 다시 2주간 후에 마우스를 죽였다.

* Student's two-tailed t-test에서대조군과 비교

표 4. 6에 나타내었듯이 종양이식 후 21일째의 외과적 절제 전에 키틴 헤파리노이드를 투여하였다. SCM-키틴Ⅲ의 7회 정맥내 투여에 의해, 용량 의존적으로 폐 전이의 억제 효과가 인지되었다. S-키틴Ⅱ도 헤파린에 비해서 강한 활성을 나타내었는데, CM-키틴에서는 효과를 나타내지 않았다. 또한, 원발과의 외과적 절제 후에 키틴 헤파리노이드를 정맥 내 투여할 경우의 결과를 표 4. 7에 나타내었다. SCM-키틴Ⅲ의 7회 투여에 의해, 설폰화도에 비례해서 현저한 폐 전이의 저지 효과를 나타내었다.

4. 1. 6  SCM-키틴Ⅲ의 암 전이 억제의 작용기작

많은 암세포는 맥관(脈管) 내에 침입하여 혈소판의 응집을 유도하고, 그 결과 표적장기(폐)의 미소관 내에 암세포의 착상을 보다 안정 또는 증강되지만 SCM-키틴Ⅲ의 투여는 헤파린만큼 강하지는 않고, 확실히 폐에의 착상(捕捉)을 억제하였다. 게다가, SCM-키틴Ⅲ의 전이 억제 기서는 면역계 세포(마크로파지나 NK세포)의 활성화 또는 殺종양성의 유도에 기초한 것은 아니라는 것을 밝혀냈다.

암세포는 기저막에 접착하여 Ⅳ형 콜라게나제 등의 메타로프로테아제나 헤파라나제 등의 각종 매프릭스 분해효소를 생산하고, 이것을 분해·파괴하여 조직 깊은 곳으로 이동하여 침윤한다. SCM-키틴Ⅲ는 헤파린에 비해서 기저막 재구성 기질에의 암세포의 침윤을 그것의 황산화도에 의존하여 강하게 저해 하지만, 항전이 효과의 인지가 없는 CM-키틴 및 N-SCM-키토산에서는 침윤의 저해 효과를 나타내지 않았다. 헤파린이 헤파라나제의 특이적인 저해물질 이라는 것이 알려져 있는데, SCM-키틴Ⅲ는 헤파린에 필적하는 강한 저해활성을 나타내었다. 한편, 기저막에 한해서 존재하는 Ⅳ형 콜라겐의 분해활성은 SCM-키틴Ⅲ에 의해 강하게 저해되는데, 헤파린은 그 효과가 거의 인지되지 않았다. SCM-키틴Ⅲ의 효소 저해 기서의 상세한 것에 대해서는 더 검토할 필요가 있다. 그림4. 4에 SCM-키틴Ⅲ의 암전이 저해활성의 작용기서에 대해서 poly(RGD)와의 비교에 있어서 나타내었는데, 기저막의 주요성분인 라미닌에의 암세포의 접착 및 라미닌 상에서의 이동能은 SCM-키틴Ⅲ 및 헤파린의 존재 하에서 상당히 저해되어 확연하게 침윤저지 효과와 잘 相關하였다. 그것의 억제 기서는 SCM-키틴Ⅲ 및 헤파린이 라미닌 분자에 가역적으로 결합하는 것에 기초하며, 그 결합 부위는 라미닌 분자 내에 존해하는 헤파린 결합 도메인일 가능성이 시사되었다.

종양 혈관 신생은 원발과 및 전이과의 암세포에의 효소·영양 공급 혈관으로써 작용에만 그치지 않고, 그 형성된 혈관을 통해서 되는 전이의 형성에 길잡이 한다는 것이 고려된다. 그 때문에 혈관 신생의 억제는 혈관성 전이의 제지와 밀접하게 관계하는 것으로 생각된다. SCM-키틴Ⅲ는 종양 이식과 동시 또는 이식 후 초기에 투여 할 경우에 유의한 혈관 신생의 억제를 나타내었다. 한편, CM-키틴 및 헤파린 에서는 효과를 나타내지 않았다. 혈관 신생의 과정은, 종양괴에서 유리한 혈관 신생인자의 자극을 받아서 주변 조직의 모세혈관에서 출아한 혈관내피세포가 기저막을 파괴·침윤하고, 종양괴에의 이동과내피세포의 증식·분화에 의한 관강(官腔) 형성 등의 단계에 의해 성립된다. SCM-키틴Ⅲ에 의한 혈관신생의 억제 기서는, 혈관 신생 시에 있어서 혈관 내피세포의 기저막에의 침윤과 종양괴에의 내피세포의 이동(접촉 走化性)을 저지하는 것에 기초한다는 것이 밝혀졌다.

이상의 결과로부터, SCM-키틴Ⅲ는 헤파린의 생리활성인 혈소판 응집·응고계의 저해 작용은 거의 나타내지 않는 것에 관계없이 현저한 전이억제 효과 및 종양 혈관 신생의 저해효과가 얻어진 점으로부터 그것의 치료 응용이 매우 유망하다고 생각된다. 그 억제 기구는, 전이 과정의 각종 단계에 있어서 전이성 암세포와 숙주와의 상호작용을 저해하는 것 즉, 접착성·이동성·침윤 등의 암세포 기능을 억제함으로써 전이 억제를 유도한다고 생각된다. 암세포 침윤 프로세스에 있어서 주변조직(세포外 매트릭스 단백)의 효소적 분해를 저해하는 것 특히, Ⅳ형 콜라게나제(메타로프로테아제계)의 효소 저해제로써 작용하는 것은 흥미깊다.

그림 4. 4  SCM-키틴Ⅲ에 의한 암세포의 기저막 침윤 제어기서의 요약

4. 1. 7  카르복시메칠(CM)키틴 겔의 드럭 딜리버리 시스템에의 응용

최근, 각종 조환 형 사이토카인이 유전자공학적 방법에 의해 생산되어 공급되게 되었다. 이 사이토카인이나 어떤 종류의 항암제 등이 생체에 투여될 때, 투여 후의 혈중의 반감기가 매우 짧고, 그 때문에 충분한 치료효과 또는 활성발현에는 고용량 또는 빈번한 투여가 필요하다고 생각된다. 이것에 의해 부작용의 발현이 현저해져서 치료상의 문제가 된다. 이러한 문제점의 한 가지 해결 방법으로써 드럭 딜리버리 시스템(DDS)의 개발이 요구되는데, 목적으로 하는 약리활성이 증강되든지 또는 특별한 영향을 받지 않든지, 부작용의 발현만을 큰 폭으로 경감·회피시키는 것이 필요하다. 그래서, 키틴 유도체의 생체 라이소자임에의한 생체 내 분해성, 비 항원성, 면역증강활성 등의 특성에 착안하여 서방성 약물 담체로써 6-O-카르복시메칠키틴 겔(CM-키틴 겔)의 개발과 그 유효성에 대해서 검토하였다.

저독성의 수용성 CM-키틴은, 3가철 이온의 첨가에 의해 고수율로 겔을 형성하며, 음파 파쇄나 교반에 의해 각종 입자경의 겔이 얻어진다. 겔 형성시에 소(牛) 혈청 알부민(BSA)이나 항암제(아드리아마이신 ADM이나 네오카르티노스타틴 NCS)를 철 및 칼슘이온과 공존시킴으로써, 비교적 고율로 쉽게 겔 내에 포함 시킬 수 있다. 이 NCS함유 겔은 라이소자임 소화에 의해 농도 의존적이고 경시적으로 붕괴되었고, in vitro에서 배지 중에 NCS를 유리하였다. 또한, NCS는 마우스의 피하에 투여 후 1시간 내에 일과성의 피크를 나타내는 빠른 소실(消失) 패턴을 나타내었고, 24시간 후에는 검출되지 않았다. 한편, NCS함유 키틴 겔의 경우는 수 시간 후를 피크로하는 패턴을 나타내었고, 48시간 후에 있어서도 NCS가 유의하게 검출되었다.

마우스의 폐 전이성 B16-BL6 또는 간 전이성 L5178Y-ML25 세포에 의한 전이는 NCS함유 겔의 2일에 3회의 피하 투여에 의해 현저한 억제 효과를 나타내었고, NCS 단독에서 격일 6회 투여의 경우와 동 정도의 유의한 효과를 나타내었다. 또한, 고 용량의 NCS 또는 NCS함유 겔을 이용한 치료 실험에 있어서 NCS의 투여기간 중에 부작용에 의한 사망 예가 다수 관찰되었지만, NCS함유 겔의 경우는 인지되지 않았다.

이상의 결과는 항암제를 겔 내에 포함시키는 것에 의해 적은 투여 횟수 및 투여량에도 불구하고 더욱 강하고 지속적인 전이 억제 효과와 부작용의 경감이 기대된다는 것, 더욱이 CM-키틴 겔은 쉽게 조제 가능하고 생체 내 분해성이라는 점으로부터 서방성 약물 담체로써 유용하다는 것을 시사하고 있다.

4. 2  키틴, 키토산 올리고머의 면역활성과 항 종양 활성

키틴, 키토산은 물에 불용성이어서 약제로서는 투여경로의 선택과 흡수성에 현저한 제약이 있다. 그래서, 鈴木(스즈끼) 등은 키틴, 키토산의 저분자화를 시도하여, 수용성 올리고머에의한 면역활성의 검토를 시도하였다. 그 결과, 정맥내(iv) 투여가 가능한 올리고머 중, N-아세틸키토헥사오스(NACOS-6), 키토헥사오스(COS-6)가 강한 활성을 나타내어, 이후에 이들 양자에 대한 마우스를 이용한 실험을 하여, 이하에 요약한 결과를 얻었다. 즉, NACOS-6 및 COS-6은 여러 종류의 마우스 동계이식 종양에 대한 정맥 내 투여에서 증식 억제효과, 종양세포의 전이 억제효과 및 원발종양 적출 후의 마우스에 있어서 종양 수반 면역의 증강효과를 나타낸다는 것, 대표적인 日和見 감염균인 Candida albicans 감염 담암 무스에 방어 효과가 있다는 것, 한편, Listeria monocylogenes 감염에 대해서도 방어효과를 나타내었다(이러한 것들은 이미 『키틴, 키토산의 응용』(技報堂 출판)에 정리하여 서술하였다). 4. 2. 1에서는 NACOS-6의 면역 조절 효과에 대해서, 4. 2. 2에서는 항 종양제의 부작용 경감을 목적으로한 NACOS-6을 캐리어로 하는 프로드럭의 합성과 그것의 항 종양 효과에 대해서 鈴木 등의 연구에 대해서 서술한다.

4. 2. 1  NACOS-6의 면역조절 효과

a. NACOS-6의 인타로이킨-1(IL-1) 생산능에 미치는 효과

BALB/C마우스의 복강 내(ip)에 카제인을 투여해서 얻은 마크로파지(MØ)에 NACOS-6, 0.1∼1□/□ 첨가하고 48시간 배양 후, 배양 상청을 정상 마우스 흉선 세포에 첨가하고, 3H-티미진의 취입능에 의해 증식율을 측정하였다. 그 결과, NACOS-6 자극 마크로파지 배양 상청은 흉선세포의 3H-티미진 취입을 未처리 마크로파지에 비해약 4배 활성화 하여, NACOS-6은 IL-1을 유도한다는 것이 판명되었다(표4. 8).

표 4. 8  NACOS-6의 마크로파지 IL-1 응답활성에 미치는 효과

	투여량 (□/□)	H-TdR의 취입 (DPM)	대조군에 대한 비율	P*1
control NACOS-6	0.01 0.1 1.0	2,125.9±122.6 2,210.3±167.4 8,339.6±134.0 9,403.9±415.6	1.0 1.1 3.9 4.4	NS*2 ＠0.01 ＠0.01

(주) *1  Student's t-test

*2  Not significant(유의차 없음)

b. NACOS-6의 임파구의 인타로이킨-2(IL-2) 생산능 및 IL-2 응답성에 미치는 효과

Meth A이식 14일째의 BALB/C 마우스에 NACOS-6 10□/□을 iv 투여한 후, 비장 T 임파구를 분리, 이 임파구에 콘카나바린A(Con A)를 가해 48시간 배양 후, 그 배양 상청을 채취하였다. IL-2 활성은, CTLL-2 세포에 배양 상청을 가하여 배양 후, 同 세포의 3H티미진 취입능에의해 측정하였다. 그 결과, CTLL-2 세포의 3H-티미진 취입능은 미처리 CTLL-2 세포의 2.7배로 NACOS-6은 IL-2를 유도한다는 것이 밝혀졌다(표4. 9). 또한, IL-2에 대한 임파구의 응답성에 대해서는 NACOS-6, iv 투여 마우스 비장 임파구에 리콤비넌트 IL-2(rIL-2)를 첨가 배양 후, 3H-티미진의 취입능에의해 검토한 결과, NACOS-6은 대조군에 비해 비장  임파구의 3H-티미진 취입능을 약 3.3배 증가시켰다. 또한, IL-2의 유도 뿐만 아니라 임파구의 Il-2 응답성도 부활化 한다는 것이 밝혀지게 되었다(표4. 10).

표 4. 9  담 암 마우스 비장 T임파구의 IL-2 활성에 미치는 NACOS-6의 영향

샘 플	투여량 (□/□)	3H-TdR의 취입 (DPM)	대조군에 대한 비율	P
control NACOS-6	10	292.7±81.9 794.5±110.7	1.0 2.7	＠0.01

표 4. 10  담 암 마우스 비장 T임파구의 IL-2 응답성에 미치는 NACOS-6의 효과

샘 플	3H-TdR의 취입 (DPM)	대조군에 대한 비율	P
control control+IL-2 NACOS-6+IL-2	106.5±13.1 228.8±28.4 759.5±75.4	1.0 3.0	＠0.01

(주) NACOS-6의 투여량

c. IL-2의 임파구 증식활성에 미치는 NACOS-6의 효과

정상 BALB/c 마우스에서 얻은 비장 임파구에 NACOS-6(1□/□)을 첨가하여 24시간 배양 후, rIL-2를 첨가하고, 48시간 배양 후의 임파구의 증식활성을 3H-티미진의 취입능으로 측정하였다. 그 결과, 임파구의 유의한 증강이 인지되었다. 또한, 同 임파구는 Meth A 종양세포에 대해서 세포장해 활성도 나타내는 것이 판명되었다(표 4. 11).

표 4. 11  담 암 마우스 비장 T임파구의 세포 장해성 T임파구 활성에 대한

NACOS-6의 영향

임파구의 유래	세포 장해 활성(%)	P
담 암 마우스 담 암 마우스 + NACOS-6 (10□/□)	12.2 ± 2.1 29.9 ± 2.4	＠0.05

(주) NACOS-6의 투여량

d. NACOS-6 투여 마우스 비장 T임파구의 마크로파지 활성화 인자(MAF)

생산능 및 MAF 응답성에 미치는 효과

NACOS-6을 BALB/c 마우스에 iP 투여하고 그 4일 후에 비장 T임파구를 채취하고, 이어서 同 임파구에 Con A를 가해서 배양 후 얻어진 배양 상청을 카제인처리 정상 BABL/c 마우스의 마크로파지에 첨가하여, L. monocytogenes에 대한 살균효과로 검토하였다. 그 결과, NACOS-6은 MAF 응답성을 증강시켰다(표4. 12).

표 4. 12 NACOS-6 투여 마우스의 T임파구의 MAF 생산능

마크로파지 유래	콜로니수(×104)	억제율(%)
배지 + 배지 NACOS-6 + 배지 배지 + 정상 상청 배지 + NACOS-6 상청 NACOS-6 + NACOS-6 상청	118.8±4.3 95.4±11.0 123.0±5.4 80.3±2.4	19.7 3.5 15.4 32.4

e. NACOS-6의 종양괴사 인자(TNF) 유도능

Meth A 종양세포를 BALB/c 마우스 서경부(鼠經部) 피하에 이식하고, 15일 후에 NACOS-6를 10□/□, iv 투여해서 얻은 혈청을 TNF에 감수성의 L929세포에 첨가하여 배양했을 때의 L929세포 수를 크리스탈바이올렛 염색하고, 0.1% 초산액으로 색소를 추출하여 620□의 흡광도에서 측정하였다. 그 결과, NACOS-6투여 담 암 마우스에서 얻은 혈청은 유의하게 L929세포를 상해하여서, NACOS-6는 TNF를 유도한다는 것이 밝혀졌다(표4. 13).

표 4. 13  담 암 마우스의 TNF 활성에 미치는 NACOS-6의 영향

혈청의 유래	실험Ⅰ	실험Ⅱ
담 암 마우스 담 암 마우스 + NACOS-6	0.48±0.05 0.25±0.23*1	0.36±0.07 0.25±0.01*2

(주) *1  P＠0.01 담 암 마우스의 혈청에 대해서.

*2  P＠0.05 담 암 마우스의 혈청에 대해서.

f. NACOS-6의 서프렛사 세포억제 작용

서프렛사 활성은 지연형과민증(delayed type hypersinsitivity : DTH) 반응으로 측정하였다. 즉, Lagrange 등의 food-pad test에 따라서, BALB/c계 마우스 鼠經部 피하에 Meth-A 종양세포를 이식 후, 14일째에 NACOS-6(10 or 100□/□)를 마우스 꼬리정맥 내에 투여하고, 종양이식 26일째에 비장 세포를 떼어내어 그것을 정상 마우스의 꼬리정맥 내에 2×107개 이입, 이입 후 곧바로 羊 적혈구(SRBC)를 발에 일차 감작하고, 4일 후에 SRBC를 마우스 발에 이입하여 2차 감작을 행하였다. 이차 감작 24시간 후에 발의 부종(浮腫) 수치를 측정하여, 담 암 상태의 마우스 비장세포 중에 유도되는 서프렛사 세포의 작용에 의한 면역능의 저하를 발의 浮腫値로 나타내고, 이 수치를 서프렛사 활성으로써 측정하였다. 그 결과, 담 암 마우스의 비장세포를 이입한 群에 있어서 발 부종의 수치는 정상 마우스의 비장세포를 이입한 군의 수치에 비해서 유의하게 저하되었지만 NACOS-6 투여 담암 마우스의 비장세포를 이입한 군에 있어서는 담 암 상태에 있음에도 불구하고 그 수치는 정상 레벨까지 회복되었고, 담 암 마우스의 비장세포를 이입함으로써 생긴 면역 억제 상태가 NACOS-6의 투여로 회복 될 수 있다는 것이 밝혀지게 되었다(표4. 14).

이상의 결과로부터, NACOS-6은 IL-1, IL-2를 유도하고 또한, 임파구의 응답성을 높이며, 더욱이 세포 장해성 임파구, LAK세포, 마크로파지의 종양세포 장해성을 활성화 하는 반면, 담 암 숙주의 서프레사 세포의 활성을 억제하여 결과적으로 숙주의 생체 방어계의 활성화를 촉진한다고 생각된다.

표 4. 14  담 암 마우스의 지연형 과민증 반응에 있어서 NACOS-6의 효과

비장의 유래	발 浮腫 (□)	P (담 암 마우스에 대해서)
미 처리 군 정상 정상 + NACOS-6(10□/□) 정상 + NACOS-6(100□/□) 담 암 담 암 + NACOS-6(10□/□) 담 암 + NACOS-6(100□/□)	0.83±0.06 0.81±0.04 0.85±0.06 0.75±0.04 0.55±0.02 0.78±0.03 0.79±0.03	＠0.05 ＠0.001 ＠0.01 ＠0.001 ＠0.05 ＠0.05

4. 2. 2  N-아세틸키토헥사오스를 캐리어로서 이용한 프로드럭의 항 종양 활성

현재 이용되고 있는 항암제의 대부분은 종양세포에 대한 특이성 뿐만 아니라 각종 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그 때문에 항암제를 종양에 특이적인 캐리어와 복합체化 함으로써 부작용 저감화의 시도가 상당히 행하여졌다. 이러한 관점으로부터, 스즈끼(鈴木) 등은 만난의 각종 장기에의 집적성과 만노스/N-아세틸글루코사민 리렙터의 존재에 착안하고 또한, 빵 효모 만난의 항 종양 활성증강과 항암제의 부작용 저감화를 목적으로써 빵 효모 만난에 마이트마이신C나 브레오마이신을 결합시킨 프로드럭의 항 종양성에 대해서 검토하엿다. 그 결과, 만난-마이트마이신C 및 만난-브레오마이신 복합체는 수 종류의 마우스 同系 이식 종양에 대해 항 종양성을 발휘하는 것이 판명되었다. 또한, 그 작용 기작은 同 복합체의 만난 리셉터에 대한 표적 지향성에 기초한다는 것이 밝혀지게 되었다. 그래서, N-아세틸글루코사민(man/GlcNAc) 리렙터에  대해서도 NACOS-6를 이용해서 포적 지향성 프로드럭의 항 종양성, 종양 전이 억제 효과에 대해서 검토한 것에 대해 서술하겠다.

a. NACOS-6와 마이트마이신C(MMC)의 복합체의 합성 방법

NACOS-6와 MMC 복합체(이하 NACOS-MMC로 약한다)이 합성은 Hashida 등의 방법에 따라 앞에 서술한 방법으로 하였다. NACOS-6에 스페이서로써 □아미노카프론산을 브롬시안법을 이용해서 도입 후, 수용성 카르보디이미드(1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide)를 탈수제로써 MMC를 축합시켜 농축 정제 후, 동결건조 하였다. 本 복합체는 수용액 중에서는 불안정하여 겔 여과 등에 의한 정제가 곤란하므로, 이번에는 동결건조 표품 그대로 사용하였다. NACOS-MMC의 추정 화학구조를 그림 4. 5에 나타내었다. NACOS-MMC의 MMC 결합율은 NACOS-6  NACOS 1M에 대해 MMC 0.17M 이었다. NACOS-6의 형광표식법은 Ghanta 등의 방법에 따라 표식하였다. 이하 NACOS-FITC로 약한다.

그림 4. 5  NACOS-MMC의 추정 구조

b. NACOS-MMC의 마우스 이식 MH 134Y 간암에 대한 항 종양 효과

NACOS-MMC는 MH134Y를 피하 이식한 마우스에 정맥 내 투여했을 때, 1□/□/日×3회의 투여량으로 47%의 증식억제 효과를 발휘하였다. 한편, NACOS-6 및 MMC의 단독 투여에서는 모두 효과가 인지되지 않았다(표4. 15).

표 4. 15  NACOS-MMC의 마우스 MH134Y 간암 이식 마우스에 대한

증식억제 효과

샘플	투여량 (□/□/日×3*1)	종양 중량 (g)	억제율 (%)	P*2
담 암 미처리군 NACOS-MMC 투여군	1 0	7.0 3.7 5.6	47 20	＠0.01 NS*3
담 암 미처리군 NACOS-6 투여군	1 10	8.2 8.0 7.8	2 5	NS NS
담 암 미처리군 MMC	0.045 0.45	6.8 7.0 7.2	-3 -6	NS NS

(주) *1 샘플은 7, 12, 17일째에 정맥 내 투여.

*2  Student's t-test

*3  Not significant(유의차 없음).

c. NACOS-MMC의 Lewis 폐암(3LL) 담 암 마우스에 대한 연명 효과

NACOS-MMC의 3LL 이식 마우스에 대한 연명 효과에 대해서 검토하였다. 3LL 종양세포를 마우스 정맥 내에 이식 후, NACOS-MMC, 1 또는 10□/□/日을 0, 3, 6, 9, 12, 15일째에 정맥 내 투여하고, 그 후의 마우스 생존율을 60일간 관찰하였다. 그 결과, NACOS-MMC는 130%의 연명효과를 발휘하였다(그림 4. 6, 실험2). 한편, NACOS-6의 단독 투여군은 미 처리 담 암 control군과 同 정도의 연명을 나타냈을 뿐이었다(그림 4. 6, 실험1).

그림 4. 6  NACOS-MMC의 3LL 담 암 마우스에 대한 연명효과

d. NACOS-MMC의 in vitro에 있어서 종양세포 장해 효과

NACOS-MMC는 MH134Y 간암 세포에 대해서 in vitro에서 종양세포 장해 활성을 나타내었고, 이 활성은 종양세포를 원심 세정하여 NACOS-MMC를 제거하여도 발휘되는 것으로부터, NACOS-MMC는 MH134Y 종양세포에 대해서 표적 지향성을 갖는다는 것이 시사되었다(그림 4. 7).

그림 4. 7  NACOS-MMC의 in vitro에 있어서 종양세포 장해 활성

e. 세포 자동 해석장치(FAC Scan)에 의한 NACOS-FITC 결합 종양세포의 해석

MH134Y 종양세포에 NACOS-FITC를 가해 양성 세포의 분포상태의 해석을 행하였다. 그 결과, NACOS-FITC를 첨가하고 37℃에서 배양한 MH134Y 종양세포는 4℃에서 배양한 세포에 비해 확연한 형광 강도의 증대가 인지되었다(그림 4. 8).

그림 4. 8  FAC Scan에 의한 NACOS-FITC 결합 종양세포의 해석

키틴의 수용성 올리고당 NACOS-6의 면역조절물질(BRM)활성의 증강 및 생체 내에 존재하는 N-아세틸글루코사민리셉터에 대한 결합성에 기초한 표적 지향성 프로드럭의 개발을 목적으로 NACOS-6에 MMC를 결합시켰다. 그 결과, 이 복합체는 마우스 이식 MH134Y 간암에 대해서 증식 억제 효과(표 4. 15), 3LL 이식 마우스에 대한 연명효과(그림 4. 6)를 나타내었다. 전에, 스즈끼(鈴木) 등은 NACOS-6가 단독 투여에서 3LL 이식 마우스에 대해 폐 전이 억제 효과가 있다는 것을 보고하였다. 그림 4. 6의 실험1에 나타내었듯이 NACOS-6의 단독 투여에서는 연명효과를 나타내지 않았다. 그러나, NACOS-MMC는 3LL 이식 마우스에 대해서는 연명 효과를 나타내었다(그림 4. 6, 실험2). 더욱이 in vitro에 있어서 직접 세포 장해성 시험의 결과, NACOS-MMC는 종양세포에 대한 결합성에 의거한 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다(그림 4. 7). NACOS-MMC에는 4.5% MMC가 존재 할 뿐이지만, 복합체化한 NACOS-MMC는 종양세포에 대한 표적 지향성를 가지며, 저 투여량으로 항 종양 효과를 발휘하는 것이 판명되었다. 더욱이, FAC Scan을 이용한 NACOS-FITC의 MH134Y 종양세포에의 결합성을 조사한 결과, NACOS-FITC는 37℃ 조건하에서는 종양세포에 대해 결합하고, 세포의 형광강도는 증대하였다. 한편, 세포의 취입 기능이 저하 또는 정지하는 4℃의 조건하에서는 종양세포와 NACOS-FITC의 결합은 인지되지 않았다. 이 결과는 NACOS-MMC가 분명히 종양세포와 결합한다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 MMC 단독에서는 얻어지지 않는다는 점으로부터, NACOS-MMC의 종양세포 표적 지향성의 메커니즘으로써, 앞서 만난을 이용해서 합성한 복합체와 같이, Man/GlcNAc 리셉터를 통해서 NACOS-MMC가 종양세포에 결합함으로써 발휘되는 것이다.

암 화학요법제는 통상 임상에서 이용되는 투여량에서는, 면역 억제 작용, 그 외의 위독한 부작용을 일으키지만, 면역 세포의 분화나 활성화의 상태에 의해서 암 화학요법제의 작용은 달라지며, 그 투여시기, 투여량에 의해서는, 담 암 숙주의 항 종양 면역의 증강을 갖는다는 것이 브레오마이신 등에서 알려져 있다. 항생물질 중에는 이러한 작용을 하는 것도 있는 점으로부터, 상기 복합체 중의 MMC량은 미량으로 면역 증강 작용을 나타낼 가능성도 있다. 금후, 더욱더 검토를 할 것이다.

여기에서 나타낸 NACOS-MMC와 종양세포와의 친화성에 관한 지견은, 표적 지향화의 유력한 방법의 하나가 될 것으로 생각되며, 앞에 보고한 항암제-만난 복합체의 지견과도 함께, 임상적 암 치료약 개발의 새로운 프로티를 나타낸 것으로 생각된다.

4. 3  고분자 키틴질의 약물 송달법에의 응용

여기에서는 키틴, 키토산의 약물송달에의 응용이 가능성을 캐기위해 행한  기초연구의 결과를 소개한다.

4. 3. 1  고분자 프로드럭의 캐리어로써의 이용

키틴, 키토산 및 6-카르복시메칠(CM)-키틴은 반응성 관능기로써, 각각 분자내에 메치롤기, 아미노기, 카르복실기를 가지고 있어서, 이것들을 이요해서 고분자 반응을 행하여 키틴, 키토산 또는 CM-키틴/약물·콘쥬게이트를 얻을 수가 있다. 이것을 고분자 프로드럭으로써 약효를 발현시키기 위해서는 투여 후 반드시 콘쥬게이트로부터 친약물의 형태로 방출되도록 분자설계 하지 않으면 않된다. 그러기 위해서는, 스페이서의 종류와 결합양식의 선택이 필요하게된다(그림 4. 9).

생분해성 다당인 키틴, 키토산을 캐리어로 한 콘쥬게이트로 부터의 약물 방출 패턴으로써는, ① 먼저 주쇄가 개열되어 올리고당/약물·콘쥬게이트가 생성되고, 그것으로부터 친약물이 방출되는 경우와, ② 최초에 콘쥬게이트로부터 약물 그것이 방출되고, 그 후에 주쇄의 다당이 분해되는 경우로 분류 할 수 있다. CM-키틴이 라이소자임 감수성이 강하다는 것을 이용하여, 도꾸라(戶倉) 등은 전자의 패턴에 의한 약물 방출을 의도한 CM-키틴/디펩티드/모델 약물·콘쥬게이트를 분자 설계하여, 약물의 이단계 방출이 가능한 데이터를 얻었다. 후자의 패턴에 의한 약물 방출은 생분해성 고분자를 캐리어로 한 콘쥬게이트에 있어서 일반적으로 생각되는 것으로, 약물을 방출한 후, 캐리어는 충분히 분해되어 체내에 축적되지 않는다는 것을 그의 특징으로하는 것이다.

키틴/약물·콘쥬게이트    키토산/약물·콘쥬게이트    CM-키틴/약물·콘쥬게이트

□ 스페이서         □ 결합

그림  4. 9  키틴, 키토산 또는 CM-키틴/약물·콘쥬게이트의 구조

후자에 속하는 콘쥬게이트의 연구로써는 기초레벨의 것이 다수 보고되어 있는데, 이하에서는 大內 등에 의해 최근 보고된 것을 중심으로 간단히 소개한다.

강한 부작용이 임상 상에서 문제가 되는 5-플로로우라실(5FU)이나 아드레아마이신(ADR)을, 大內 등은 키틴, 키토산, CM-키틴 등에 담지(擔持)한 콘쥬게이트를 i.P. 투여하고, 무 처리 군에 대한 처리 군의 생존일 수의 비를 구해서 연명율로써 평가하였다. 프리의 5FU의 경우에는, 투여량이 일정치를 초과하면 그 독성 때문에 연명효과가 급격히 저하되는 것이 비해서, 키틴/우레탄/C6/우레아/5FU, 키토산/우레아/C6/우레아/5FU, CM-키틴/아마이드/C5/에스테르/C1/5FU·콘쥬게이트의 경우에는, 높은 투여량에 있어서도 연명율이 상승하였고, 또한 마우스의 급격한  체중감소 등도  인지되지 않아서, 콘쥬게이트化라고 하는 수단에 의해, 5FU의 서방효과가 나타나고, 부작용이 경감될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, CM-키틴을 캐리어로 하는 콘쥬게이트는 미 반응 CM이 잔존하므로, 상당히 수용성이 높아 주사용 제제로써 임상 응용될 가능성이 높다.

더욱이, MH134Y-종양세포 또는 Meth-A 종양세포를 피하 이식한 담 암 마우스에 대해서 콘쥬게이트를 정맥 투여해서, 이들 고형 종양에 대한 증식 억제 효과가 조사되었는데, 키틴 또는 올리고키토산/우레아/C6/우레아/5FU·콘쥬게이트는, 5FU, 키토산 및 이들의 혼합물보다도 높은 증식억제 효과를 나타낸다는 것이 발견되었다. 鈴木 등도, N-아세틸키토올리고당(NACOS)/마이트마이신C·콘쥬게이트에 의한 담 암 마우스의 제암 효과에  대해서 검토를 가하여, 이 콘쥬게이트가 MH134Y에 대해서  높은 종양 증식 억제효과를 나타내는 것을 발견하였다. 그 이유로써, 종양세포에 대한 NACOS의 높은 특이적 친화성이 떠오른다.

고분자 프로드럭으로부터 약물이 방출되어 표적 세포 내에 도달하는 경로에는, 세포 外에서 가수분해를 받아 약물이 방출된 후, 확산에 의해 세포 내에 진입하는 패턴과 콘쥬게이트의 형태 그대로 엔도사이트시스에 의해 세포 내에 취입된 후, 라이소자임 내에서 가수분해를 받아 약물이 세포질 中에 방출되는 패턴이 고려된다. 大失 등은 후자의 라이소자임의 역할에 착안하여, 이 라이소자임 중에 존재하는 효고에 의해 선택적으로 개열을 받도록 하는 스페이서를 이용해서 CM-키틴에 ADR을 擔持한 라이소자임 지향성 고분자 프로드럭의 분자 설계에 대해서 검토를 가하였다. 즉, 라이소자임 효소 감수성의 테트라펩티드 Gly-Phe-Leu-Gly을 스페이서로써 이용한 CM-키틴/Gly-Phe-Leu-Gly/ADR·콘쥬게이트를 합성하여 in vitro에서의 ADR 방출 거동과 in vivo에 있어서 제암활성을 조사했을 때, 이  콘쥬게이트는 라이소자임 효소 감수성의 약물 방출형으로, 담 암 마우스에 대해서 높은 연명 효과를 나타낸다는 데이터가 얻어졌다.

4. 3. 2  매입형 DDS용 캐리어로써의 이용

매입형 DDS로써는 침, 펠렛트, 錠劑 등 각종 齊形 설계가 검토되었는데, 보통은 약물과 고분자물질의 복합체 형성물로써 이용되며, 약물의 장기 서방화를 목표로 해서 만들어진다.

도변(度□) 등은, CM-키틴을 Fe(Ⅲ) 이온으로 가교 시켜서 하이드로겔을 형성하고, 이 겔에 포매(包埋) 시켜서 제암제의 서방화를 이루었다. 또한, 최근, 학곡(鶴谷) 등은 제암 활성은 높지만 동시에 부작용이 특히 강하다고 알려진 항암제인  시스프라틴(CDDP)에 착안하여, 부분탈아세틸화 키틴과 CDDP와의 결합체(프라키틴)를 성형물로써 담 암 동물에 매입하여, 서방효과와 제암 효과에 대해서 검토를 가하였다. 그 결과, 3개월 이상에 걸친 장기 서방화가 달성되었고, 賢 독성을 중심으로한 부작용이 경감되고 CDDP가 가진  제암 활성이  유지된다는 것이 밝혀졌다.

또한, 이 프라키틴은 부분탈아세틸화 키틴의  아미노기와 CDDP 중의 클로르기가 반응하여 공유결합으로 되어있지만, 그 구조의 자세한 것은 밝혀지지 않았다.

4. 3. 3  약물 송달용 캐리어로써의 키토산·미크로스페어의 이용

키토산·미크로스페어를 DDS용 캐리어로써 이용하는 시도는 다수 행해져 있는데, 여기에서는 최근 大內에 의해 검토된 약물 송달용 미크로스페어의 심지로써의 키토산·겔·미크로스페어의 이용에 대해서 간단히 기재한다.

W/O 에멀젼법과 초음파법을 병용하여  키토산을 글루타르알데하이드로 가교 시킨 입자경 0.3□의 키토산·겔·미크로스페어(MS(CM))을 조제하고, 이것을 심지 물질로써 5FU나 5FU의 아미노 유도체를 함유 또는 공유결합 고정시키고, 다당 또는 지질로 피복한 미크로스페어의 齊形 설계에 대해서 검토하였을 때, 지질의 상 전이 현상을 이용하는 것에서 약물 방출의 ON-OFF 제어가 가능해 졌고, 피복 다당 또는 당지질의 종류를 선택함으로써 MS(CM)에 세포 인식능을 부여 할 수 있다는 것이 in vitro의 실험에서 알 수 있었다.

더 나아가, 上記한 보고 예는 기초적 연구의 범위를 벗어나지 못한 것이 대부분이다. 금후는 더욱 통합된 기초 연구를 쌓아 올려, 임상 실험에 의한 객관적 약효 평가와 안전성의 검증을 더하여, 실용화에의 길이 열리도록 하여야겠다.

그림 4. 10  MS(CM)을 심지 물질로 한 각종 미크로스페어로부터의

프리 5FU의 방출 양식